文档介绍：分子生物学实验 Experiments of molecular biology
实验四 PCR扩增目的基因
实验二 PCR扩增目的基因
【目的要求】
;
;学会设计PCR引物;
,学会如何优化PCR。了解PCR产物的保存方法;
【实验器材】
PCR仪,台式离心机,微量移液器(10μl、 100 μl、 1000 μl ),150μl Enpendorf管,电泳设备等
【实验材料】
pADH的PMD-20T质粒的模板,引物,4dNTP mix,Taq酶,10X PCR缓冲液、无菌水,琼脂糖,DNA染料,电泳缓冲液等。
【实验内容】
PCR基础知识介绍;
PCR的基本原理;
PCR引物设计原则;
PCR的基本过程及程序设计;
【实验原理】
1)合成待扩增区域两端已知序列,与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物,引物的序列决定扩增片段的长度;
2)PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤:变性、退火和延伸,3个步骤作为PCR的一个循环,每当完成一个循环,一个分子的模板被复制为二个,产物量以指数形式增长。
变性 Denaturation
94~95℃,1min
复性 Annealing ~55℃,1min
延伸 Extension 70~72℃,1min
72 ℃延伸10min DNA扩增100万倍
【操作步骤】
1. 建立PCR反应体系(依次混匀下列试剂)
组成成分加入量(μl)
DNA模板(质粒) 1
引物P1
引物P2
4XdNTP Mix 2
10XPCR缓冲液
Taq 酶
H2O
总体积 25
2. 设定PCR循环参数:
Temperature
Time
Cycles
94 ℃
5 min
1
94 ℃
30 sec
20
55 ℃
30 sec
72 ℃
1min20sec
72 ℃
8 min
1
3. PCR管内加好上述试剂之后要充分混合,然后离心数秒,放入PCR仪上。
4. 编辑PCR反应程序,完成后启动PCR仪, 电泳。
PCR完成后,取5μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
电泳结果如图所示
[注意]
PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。
加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
思考题
?
?
?为何?
,可能有哪些原因?
对PCR的优化是必需的!!!
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