文档介绍：第二军医大学
博士学位论文
Siglec-1介导巨噬细胞炎症反应在动脉粥样硬化发病中的研究
姓名:熊怡
申请学位级别:博士
专业:临床医学、临床检验诊断学
指导教师:仲人前
2011-05
Siglec-1 介导巨噬细胞炎症反应在动脉粥样硬化发病中的研究
摘要
研究背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是缺血性心脑血管疾病的病理基础,
其发病机制至今尚未阐明。近年来认为免疫炎症特别是由巨噬细胞介导的天然免疫在
AS 的发生发展中起重要作用。Siglec-1(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin
1,唾液酸黏附素,又名 CD169)作为单核巨噬细胞激活的重要标志,在 SLE、系统
性硬化、HIV 感染等自身免疫性疾病和炎症性疾病外周血及病变组织表达增高,并参
与分泌细胞因子和激活 T 淋巴细胞等过程。但其在冠心病发病过程中的作用还不清
楚。

目的:本研究拟通过外周血分析、体外细胞培养和体内动物实验三个层次,研究
siglec-1 在冠心病患者中的表达及其在 AS 发病过程中的作用,探讨 siglec-1 作为评价
疾病活动性的指标或作为潜在治疗靶点的价值。

方法:
(1)外周血表型分析
a) 流式细胞仪检测冠心病病人和正常对照组外周血单核细胞 CD14CD169 双阳性细
胞比例。
b) 分离外周血单个核细胞,抽提总 RNA,反转成 cDNA, 实时荧光相对定量 PCR 检
测 siglec-1 mRNA 表达情况。
c) 根据冠状动脉造影结果,计算冠心病病人冠状动脉狭窄程度评分 Gensini Score,
并与 siglec-1 表达作相关性分析。
d) 检测冠心病危险因子超敏 C 反应蛋白(hs-CRP)和同型半胱氨酸(HCY), 并与
siglec-1 表达作相关性分析。
(2)体外细胞培养
a) 体外培养巨噬细胞株及原代小鼠骨髓巨噬细胞。
b) 各种刺激剂如 ox-LDL、M-CSF、INF-α等刺激巨噬细胞 siglec-1 高表达;小干扰
RNA 或抗体阻断技术抑制 siglec-1 表达。
c) 观察各组巨噬细胞分泌趋化因子 MCP-1、MIP-1alpha、MIP-2 和吞噬 ox-LDL 的能
力。
d) 磁珠分选外周血 CD4+、CD8+、CD14+细胞,单核细胞( CD14+)和淋巴细胞( CD4+、
CD8+)混合培养观察单核细胞 siglec-1 抑制和表达增强后刺激 CD4+和 CD8+T 淋巴
细胞增殖和分泌细胞因子的变化。
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(3)动物实验
a) 高脂喂养 ApoE-/-小鼠建立动脉粥样硬化模型。
b) 构建带 siglec-1 小干扰序列的慢病毒载体和对照病毒载体,尾静脉注射小鼠,靶向
敲除 siglec-1 后再高脂喂养 4 个月,观察小鼠粥样斑块形成。
c) 免疫组化观察粥样斑块中 CD4+T 细胞、CD8+T 细胞及巨噬细胞数量。
d) 荧光定量 PCR 检测主动脉 IL-1β、TNF-α炎性细胞因子分泌情况。

结果:
(1)外周血表型分析
a) 流式细胞仪检测发现,Siglec-1 在正常对照组及冠心病组淋巴细胞和中性粒细胞上
均无表达;冠心病组单核细胞 CD14CD169 双阳性率为(±)%,显著高于健康
对照组的阳性率[(±)%,P<]。
b) 冠心病组 Siglec-1 mRNA 的平均拷贝数显著高于健康对照组,为健康对照组的
倍;而冠心病血脂正常组和血脂异常组的 Siglec-1 阳性率和 mRNA 平均拷贝数
均无明显差异。
c) 冠心病患者 siglec-1 mRNA 表达和冠心病严重程度评分 Gensini Score 及炎症活动
指标 hs-CRP、HCY 三者成正相关(相关系数 r 和 p 值分别为: r=, P=; r=,
P=; r=, P=)。
(2)体外细胞培养
a) 各种刺激剂如 ox-LDL、M-CSF、INF-α等能有效刺激巨噬细胞 siglec-1 高表达;
小干扰 RNA 或抗体阻断能特异性抑制 siglec-1 表达。
b) siglec-1 高表达后可以明显促进巨噬细胞 MCP-1、MIP-1alpha 及 MIP-2 的分泌和吞
噬 ox-LDL,而 siglec-1 表达降低后上述作用逆转。
c) 冠心病患者外周血 CD14+单核细胞比正常人单核