文档介绍：第二军医大学
硕士学位论文
贻贝抗菌肽Myticin A的克隆表达及生物学活性研究
姓名:仲燕
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:冯伟华
20040501
缩略词表——————————————————————————————————————一硕士学位论文贻贝抗茸肤肼目寺”硭俑采镅Щ钚匝芯瓺’疭—猼ぁ·

贻贝抗菌肽目寺”泶锛吧镅Щ钚匝芯中文摘要近年来在海洋软体动物贻贝中发现了新的抗菌肽家族。该家族是由特定基因天然产量低,合成抗菌肽的价格又太昂贵,因此应用基因工程技术对其进行克隆菌有抑制作用,但对革兰阴性菌和真菌的抑制作用不明显。本课题选择为研究对象,首先从贻贝体内应用方法获得抗菌肽颉H后将其克隆到毕赤酵母表达载体中,获得的湍腹こ叹鼙泶镪荼纯员泶镅方写炕突钚匝芯俊虻目寺『椭刈樵靥錺一的构建;⒈泶镅贩掷搿⒋炕⒓ḿ吧镅Щ钚缘牟舛ā⑻崛￡荼刺逡鹤躮孀B己铣蒫琍扩增得到巍产物纯化后与甌连接,转化大肠杆菌庑蛏秆〉玫阳性重组克隆载体甅⒔玀蚨ㄏ虿迦氡铣嘟湍阜置诒泶镌靥錺和中,咝曰蟮绱┛鬃;帘铣嘟湍杆拗菌小I秆〉玫礁呖剐匝粜跃杲屑状加盏急泶铩⒍苑⒔,根据贻贝抗菌肽家族一级结构的不与表达,将是研究和开发利用抗菌肽的一条有效途径。是贻贝抗菌肽中的一种,含有个氨基酸,对革兰阳性研究的主要内容:⒅刈楸泶镌靥錺狹墓菇ǎ诒铣嘟湍腹こ叹鶪/—中的诱导表达;得到的重组表达载体鉴定表达样品。⒍源炕泶镅方锌咕鸵种浦琢鱿赴さ壬镅Щ钚灾副甑墓鄄臁同可以将其分为椋篋,,和S捎诳咕菌肽方法:硕士学位论文贻皿抗茵肤的克隆表达及生物学活性研究中丈摘要
⒔玬孀B己铣蒫云湮D0澹琍扩增得到筛选得到高抗性多拷贝阳性表达菌株痯狹9こ叹甲醇诱导后,其发酵上清中含有重组表达的⒈泶锊锓掷氪炕ǎ①发酵上清液透析浓缩,②将活性峰进行阄觯玫个峰,经抗菌和抑制肿瘤细胞生长活③㈥荼纯咕腗奶逋馍镅Щ钚约觳猓扩散法测定纯化产品的抗菌活性,结果显示其对巨大芽胞杆菌锢佳粜跃的生长有显著的抑制作用。应用细胞毒检测方法发现纯化的产品对小鼠成纤维细胞、胰腺癌细胞、结肠腺癌细胞的生长均有明显抑应用毕赤酵母表达系统能较好的表达抗菌肽浔泶锪吭颊急铣酵母发酵上清液总蛋白的%以上。此抗菌肽经甋蟹治霾进行鉴定。生物学活性研究证实其具有抗革兰阳性菌作用和明显结果:因片段,经蛄蟹治觯な灯湫蛄杏胛南妆ǖ赖奶烊豢咕腗蛴雙连接,转化大肠杆菌秆〉玫窖粜重组克隆载体甅⒕璂序列分析证实。蚨ㄏ虿迦氡铣嘟湍阜置诒泶镌靥錺中,得到重组表达⒕盖兄な怠S肂又刈樵靥虻腄片断,与进行重组,经⒔玴线性化后电穿孔转化至毕赤酵母宿主菌校—证实其分子量为,与预期分子量相同,表达量为%以上。层析,得到龇澹咕鸵种浦琢鱿赴せ钚圆舛ǎ钚苑逦5峰;性测定,活性峰为第澹詹锎慷却锏ヒ陨稀结果显示有一特异杂交条带,说明所表达样品为。结论:全相同。载体籑邢潞琈双酶切和蛄蟹治觯竦弥刈楸泶镌靥錺狹制作用。用疎硕士学位论文贻贝抗茵肽目寺”硭偌吧镅Щ钚匝绣中文摘要
关键词:贻贝:抗菌肽;重组质粒;毕赤酵母;表达的抑制肿瘤细胞生长的作用。硕士学位论文贻贝抗茼肤的克隆表达及生物学活性研究中文摘要
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前言琈琈蚆荼ǖ溃琈饕6愿锢佳粜机体受到病原微生物侵袭时迅速产生和释放,以杀伤入侵的病原微生物,这是一种天然非特异性反应㈨】。因此,抗菌肽是宿主防御病原微生物入侵的一种分子物,如植物、昆虫及脊椎动物分离到数百种抗菌肽【孙。研究发现抗菌肽具有一些独特的特性:如强的抗菌活性、广谱的抗菌范围以及免疫原性低等特点。大多数抗菌肽在组成和作用机制上有一定的相似性,例如,欢送缓ò彼帷⒗蛋膜结合,继而形成跨膜离子通道,造成膜内的通过离子通道大量外流,合成下降,最终菌体不能保持正常的渗透压而死亡。但是,抗菌肽确切的作用机制以及选择性作用基础还没有阐明。不同抗菌肽可能存在多种作用机制,同样对于不同微生物,不同抗菌肽作用机制可能不止一种