文档介绍：中国农业科学院
硕士学位论文
微生物来源CpG疫苗佐剂筛选研究
姓名:刘艳环
申请学位级别:硕士
专业:特种经济动物饲养学
指导教师:杨福合
20060601
摘要找出醺缓珻—男蛄校煌保诩焖鹘诹瞿飧司嗣ǖ鞍谆蛑械腃—狣是一些具有免疫激活功能的以未甲基化的蛭:诵牡腄序列,它包括含虻娜斯ず铣傻墓丫弁蜒鹾塑账岷妥匀唤缰械偷壬锏幕蜃4罅垦芯恐な担琧—谔迥谕饩艽碳ざ嘀置庖呋钚韵赴置诙嘀窒赴因子并能调节某些表面分子、趋化因子、粘附因子和共刺激分子等,诱导机体天然免疫系统活化,并产生抗原特异性的获得性免疫应答。本项研究依据狣的特性,合成和克隆了条狣序列,通过体外筛选及动物免疫试验选出置庖咝Ч谩踩ǹ煽康男蛄校狢—庖咦艏劣用打下了基础。研究内容如下:从四种非致病性的食品酿造菌莶菅挎吒司⒌率先樗峋⒒粕ǘ谈司双歧杆菌蜃橹姓页魿—蛄校杀本┗4笾猩萍挤⒄褂邢薰竞成;在坏死梭杆菌保护性抗原基因筛选工作中,克隆了许多基因片段质粒,从中过程中,发现徒诹瞿飧司嗣ǖ鞍谆蛑蠧—拷细撸ǹ寺〉幕邓浪杆菌基因片段质粒菌株与节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因质粒菌株分别提取质粒,酶切后回收目的狣片段。无菌采取羊、小鼠血液,肝素钠抗凝。用淋巴细胞分离液分离羊、小鼠淋巴细胞。通过淋巴细胞增殖试验筛选出侄匝颉⑿∈罅馨拖赴加薪锨肯赴鲋匙用的序列。将淋巴细胞增殖试验选出的狣进行动物安全性试验,结果均无毒副作用。分别用坏死梭杆菌抗原、重组节瘤拟杆菌纤毛蛋白抗原制备弗氏完全佐剂疫苗、氢氧化铝胶佐剂疫苗、狣佐剂疫苗、狣氢氧化铝胶佐剂疫苗免疫小鼠,发现狣单独作为佐卉Ⅱ免疫期较短,狣与氢氧化铝胶配合制成狣氢氧化铝胶佐剂疫苗后与弗氏完全佐剂疫苗有几乎同样的免疫效果,明显好于氢氧化铝胶佐剂疫苗,质粒酶切回收的狣片段与完整质粒免疫佐剂作用无明显差别。关键词:狣,免疫佐剂,疫苗
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第一章绪论研究目的和意义国内外研究现状特异性免疫是含有的反应物与天然免疫细胞上的嘟岷希せ钐烊免疫应答,从而活化抗感染途径。并最终激活获得性免疫系统的过程”“。高度纯化的新型疫苗因缺少成分,不能被天然免疫细胞的芎檬侗穑蛔阋圆生引起免疫应答的有效信号。狣作为佐剂可以克服新型疫苗不足的缺陷,通过模拟感染过程诱导强烈的免疫应答“”。如呙纾贒疫苗中由于携带抗原编码基因的载体丛从谙妇缓珻—蛄校佣Vち薉疫苗在机体内只通过微不足道的抗原蛋白表达量就能激发机体产生强烈的免疫应答。本项研究为筛选适合坏死梭杆菌抗原及重组节瘤拟杆菌纤毛蛋白的狣佐剂以及动物试验需要,通过淋巴细胞增殖试验筛选出对羊、小鼠淋巴细胞都有较强细胞增殖作用的序列,分别用坏死梭杆菌抗原、重组节瘤拟杆菌纤毛蛋白抗原制备弗氏完全佐剂疫苗、氢氧化铝胶佐剂疫苗、狣佐剂疫苗、狣铝胶佐剂疫苗免疫小鼠,观察狣及含狣序列的质粒单独作为佐剂,以及与氢氧化铝胶配合制成的狣铝胶佐剂的效果,为狣佐剂的研制与应用提供理论依据,为坏死梭杆菌及重组节瘤拟杆菌纤毛蛋白疫苗佐剂的研制奠定基础狣是一些具有免疫激活功能的以未甲基化的蛭:、病毒、无脊椎动物等低等生物的基因组基序侵敢焕嘁苑羌谆奏ず湍襦堰屎塑账嵛:诵牡墓丫弁蜒鹾颂呛塑酸,其碱基排列大多遵循以下规律:宋个嘌呤,宋个嘧啶。研究表明。这种序列可激活多种免疫效应细胞,因此又被称为免疫刺激蛄小长期以来,蝗衔V痪哂薪先醯拿庖咴裕岩砸鸹迩苛业拿庖叻从Α虽然早在年等⋯头⑾钟霉丫弁蜒鹾塑账嵊朊嘌蚝煜赴黄鹱⑸湫∈螅可明显提高小鼠对绵羊红细胞的免疫应答水平。并首先提出寡聚脱氧核苷酸具有免疫佐剂的观点。但是,拿庖叩鹘谧饔帽还惴喝鲜逗椭厥邮窃旰蟮中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论
庖叩暮蠧序列的质粒⑾制湓诮峁股峡煞治A讲糠郑鹤B嫉ノ编騎时活性最强。等“”通过研究发现虻’端是细胞内受体识别位点,诵纬伞胺⒖ā被蚨厶褰峁故保蚧嶙璋芴宓氖侗鸷徒岷稀使信号传导通路受阻。骨架长度狣最佳免疫效果的发挥需要有一个适宜的长度。等激活性的序列为包含上述蛟龊溯阉岵谢。等认为要激活细胞不能少于个碱基。但随后的研究认为含有个碱基的狣能产生同样的免疫效果““,可见要产生有效的免疫应答,狣的长度不能少于个碱基。回文结构小组根据编码鞍椎腸铣闪瞬煌蛄械腸—在对这些狣免疫学特性的研究中发现,并非所有的狣都能引起机体的免疫反应,只有那些含有一个或多个回文序列的狣才具有免疫学活性。等通过对人工合成的含有塑账岬腃—嘁硇蛄泄鄄旖峁为讲嘈蛄斜匦胄纬苫匚慕峁梗艺庵只匚慕峁钩鱿值钠德试礁撸蛎庖叽激性越强。但等⋯陆芯咳衔猚侧翼序列的回文结构对其免疫刺激作用硫代磷酸酯、硫代磷酸甲酿等物质修饰后的含虻腸—渎菪榷ㄐ浴熔点、抗核酸酶降解能力、细胞对虻纳闳〉任锢硇灾识挤⑸烁谋洌⑶免疫活性