文档介绍：第三军医大学
博士学位论文
微小RNA miR-1和miR-206促进成肌分化的作用及其机制研究
姓名:王涛
申请学位级别:博士
专业:军事预防医学
指导教师:粟永萍
20081101
微小和促进成肌分化的作用及其机制研究达的面鯝诔杉》只械谋泶锉浠ü∪庾橹匾摘要异性,提示它们与该组织的分化和特定功能的维持有关。早期的鼬蛆寺〗峁矾的非编码小肿樱诘骺靥囟ㄏ赴鲋场⒎只痰确矫基于高通量芯片的组织表达谱分析显示,““对成肌分化的影响,并利用生物信息学和相关实验手段预测、分析和验证它们可能的靶基因,同时检测这些錋谀承┘∪馑鹕斯讨械谋泶锉浠驛骺毓趋兰≡鲋秤敕只姆肿踊啤⑻剿鞒商甯上赴ㄏ蚍只男虏呗蕴峁利用成体干细胞珹进行细胞替代治疗或联合基因治疗是近几年提出的修复组织损伤的新思路。基于成体干细胞的治疗策略能否安全、有效的达到目的在很大程度上取决于我们对成体干细胞增殖与分化的分子机制的认识。细胞分化的核心问题是基因表达在时间和空间上的精确调控,一种新的细胞表型的建立需要相关调控基因的打开和关闭以适应新的功能。近年来发现,一类叫做起着重要作用,特别是其在维持干细胞定向分化和自我更新功能中的作用逐渐被揭示,成为目前干细胞研究中的一个新的亮点和热点。某些具有组织表达分布的特织呈特异性表达,而它们在肌肉发育、增殖和分化中的作用尚知之不多。明确这些在成体干细胞增殖分化中的作用,将为我们利用成体干细胞进行相关肌损伤修复治疗提供新的线索。因此,本课题拟利用肌母细胞逋獬杉》只P停觳饧∪庾橹匾煨员并构建相应的治疗性载体,初步探讨其在促进成肌分化中的意义,为进一步探明本研究内容主要包括三部分:一、肌肉组织特异性在赴逋獬杉》只讨械谋泶锔谋建立赴逋獬杉》ü态学改变,肌球蛋白重链免疫荧光组织化学和肌分化相关基因的’对上述模型进行评价,采用检测肌肉组织特异性的和在理论指导和实验依据。第三军医大学博士学位论文
采用生物信息学方法,,锄检测、和胞浆阳性,觳鈓蛃郑產分化相关基因诱导分化后表三、检测肌肉组织特异性魽诠趋兰∈窬踔械谋泶锉浠⒐菇╩—上述模型的表达变化情况。二、虸促进成肌分化的作用和机制研究根据上述研究结果并结合最新进展,确定进一步深入研究蚻在成肌分化过程中的功能。化学合成和湟亩┑呐ǘ确直鹱H局赴纬蒰畂刺蠼杏盏挤只捎眯翁А⒓∏。可能作用的候选靶基因。根据上述研究结果并结合最新进展,∮雖利用荧光素酶报告系统验证候选靶基因。为了明确荧光素酶报告系统的敏感性和特异性,=挥诤蜓“谢性测作用位点约蚩寺≈羛希甃内荧光素酶,并进行酶切和测序验证。,。在该模型的表达变化。着眼于以后的治疗应用,利用有∈蠡蜃槔┰,;,通过同源重组获得腺病毒载体质粒,转染安《究帕#琋验证成熟泶锴榭觥@胢重组腺病毒感染赴盏挤只通过形态学、。通过以上三部分的实验研究与分析,获得以下主要结果:⒊晒细胞体外成肌分化和以產为干预因素的抑制分化模型。赴%马血清进行成肌分化诱导,杉嗪思」埽庖哂ü獬达明显上调,证实我们所建立的赴杉》只P褪浅晒Φ摹A硪环矫妫鄄到,產是赴杉》只母合虻骺匾蜃印#》只喙的标志分子均不同程度受到抑制,》只哪P停糜诤笮第三军医大学博士学位论文和泶锵喙亓5幕颉是否与靶基因发生相互作用。
深入研究。%;。⒚魅妨思∪。在正常成肌分化模型中三者随着诱导时间的延长,在分化过程中表达量升高明显;在诱导分化培养基中加入/【后成肌分化受抑,三者表达也受到明显抑制。⒔。,诱导蠼行вζ兰邸=,.。在產椋髯镸阳性细胞数目明显少于ⅲ甉组,转染和笥胍跣远哉毡冉希琈阳性细胞数目明较多,.,加入產这一干预因素后,凸显了和拇俜只вΑ⒎⑾@迷谙呱镄息学软件、和预测蚼可能作用的靶基因,并结合其在成肌分化过程中的表达变化特点确定虵两个基因做进一步变化特点。进而,ü馑孛晒菇╬瓹.、—,