文档介绍：东北农业大学
硕士学位论文
来源于Pedobacter sp. MJ11的α-半乳糖苷酶基因克隆、表达
及其性质研究
姓名:刘小丹
申请学位级别:硕士
专业:微生物学
指导教师:许修宏
20090612
摘要
摘要
α-半乳糖苷酶(α-galactosidase, α-D-galactoside galactohydrolase; EC )也称蜜二糖酶,是
一种外切糖苷酶。催化移除不同底物中α-连接的末端非还原性 D-半乳糖。α-半乳糖苷酶广泛存在
于动物、植物、微生物中。而微生物种类繁多、分布广泛、适应性强,因此是α-半乳糖苷酶的主要
来源。α-半乳糖苷酶按其氨基酸序列的相似性被分类到糖苷水解酶(GH, glycoside hydrolase )的
第 4、27、36 和 57 家族。27 和 36 家族是该酶的主要来源,其中 27 家族α-半乳糖苷酶主要来源于
真核,36 家族α-半乳糖苷酶主要来源于原核。α-半乳糖苷酶在医疗、食品、化工及饲料等方面有
着广泛的应用。目前α-半乳糖苷酶研究中存在的问题一是性质优良的α-半乳糖苷酶发现,另一个
是α-半乳糖苷酶的高效表达及规模化的生产,以解决应用中的一系列问题。
本研究利用生物信息学方法,通过对来源广泛的 36 家族的α-半乳糖苷酶序列进行比对和分析,
确定 36 家族分子量在 70-80kDa 的α-半乳糖苷酶蛋白序列保守基序为 D-D-G-W 和 E-P-E-M,设计
简并引物,通过简并 PCR 扩增得到 Pedobacter sp. MJ11 的基因片段,通过两步 TAIL-PCR 方法拿到
基因全长。来源于 Pedobacter sp. MJ11 的α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中异源表达,并验证其基因
功能,酶纯化后进行了详细的酶学性质研究。
来源于 Pedobacter sp. MJ11 的α-半乳糖苷酶基因,由 2166 个碱基编码 721 个氨基酸和一个终
止密码子。该基因属于糖苷水解酶 36 家族,氨基酸序列和已报道的来源于 Bacteroides
thetaiotaomicron 的α-半乳糖苷酶有最高相似性为 54%,因此该酶基因具有很高的新颖性。
重组酶 Aga-MJ11-H 蛋白理论分子量约 80 kDa[AC1],该蛋白经过中国科学院动物研究所质谱
检测中心 MALDI-TOF-MS 及 LC-ESI-MS/MS 做进一步检测正确。重组酶 Aga-MJ11-H 的最适温度
是 40℃,最适 pH[AC2]为。该酶的 PH 稳定性在 - 之间。重组酶 Aga-MJ11-H 对低聚糖
如蜜二糖、水苏糖和棉子糖进行了水解实验,对这三种底物均有一定的水解能力。以 pNPG 为底物
测得 Km 是 ,以蜜二糖为底物测得 Km 是。重组酶 Aga-MJ11-H 对蛋白酶 K、枯
草杆菌蛋白酶和α-糜蛋白酶有很好的蛋白酶抗性,将来可能在饲料添加剂方面有一定的应用前景。
就目前研究而言,该酶是糖苷水解酶 36 家族里,来源于 Pedobacter
酶。

关键词:α-半乳糖苷酶,糖苷水解酶 36 家族,Pedobacter sp.,基因克隆,异源表达,性质

I
Abstract
Gene Cloning, Expression and
Characterization of α-galactosidase from
Pedobacter sp. MJ11
Abstract
α-Galactosidase or melibiase (α-D-galactoside galactohydrolase; EC ) is an exoglycosidase
that catalytically removes α-linked terminal nonreducing galactose residues in different substrates.
α-Galactosidase was widely distributed in animals, plants and anisms. And anism was
the main sources of this enzyme for their various species, widely distribution and strongly adaption. Based
on the amino acid sequence