文档介绍：大肠杆菌感受态细胞的制备
重组DNA的转化、克隆筛选
通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆
菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受
体菌细胞的技术以及筛选转化体的技
术。了解细胞转化的概念及其在分子
生物学研究中的意义。
感受态细胞( Competent cells)
受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,
RuC等化学试剂法)的处理后,细胞膜的
通透性发生变化,成为能容许多有外源
DNA的载体分子通过的感受态细胞
( competent cell)。
转化( transformation)
是将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细
胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程
等研究领域的基本实验技术
进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现
遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性
状。转化过程所用的受体细胞一般是限制一修
饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和
甲基化酶的突变株。
转化的方法
(热击法);使用化学试剂(如
CaCl)制备的感受态细胞,通过热击处
理将载体DNA分子导入受体细胞;
:使用低盐缓冲液或水洗制备的
感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
克隆的筛选:
主要用不同抗生素基因筛选。常用的
抗生素有:氨苄青霉素、卡那霉素
氯霉素、四环素、链霉素等
将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养
基中培养,才能较容易地筛选出转化体,
即带有异源DNA分子的受体细胞。否则,
如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素
的培养基平板上,会出现成千上万的细菌
菌落,将难以确认哪一个克隆含有转化的
质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细
菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖
但对于连接混合物而言,此时并不能确定
哪个克隆含有插入片段。
重组质粒克隆的鉴定
鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有a
互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、
插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最
常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶
切分析,对于带有LacZ基因的载体还可以
结合α-互补现象来筛选。
a-互补现象
因为有些载体都带有一个LaCZ基因的调控序
列和头146个氨基酸的编码信息,编码α-互补
肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖
苷酶实现基因内互补(-互补)。当这种载
体转入可编码β一半乳糖苷酶C端部分序列的
宿主细胞中时,在异丙基-β-D硫代半乳糖苷
(IPTG)的诱导下,宿主可同时合成这两种
肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们
可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所
以称这种现象为c-互补现象。
由互补产生的β一半乳糖苷酶(LaCZ)能够作
用于生色底物5一溴-4-氯-3-吲哚一β
D一半乳糖苷(X-ga)而产生蓝色的菌落,所
以利用这个特点,在载体的该基因编码序列
之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个
外源DNA片段时,会造成LacZ(o)基因的失活
破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶
所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重
组质粒的菌落为蓝色。