文档介绍：基因工程（二）基因工程的基本操作程序
编稿：闫敏敏审稿：宋辰霞
【学****目标】
1、理解获取目的基因的方法。
2、（重点、难点）理解基因表达载体的构建原理。
3、理解将目的基因到入受体细胞的方法。
4、理解目的基因的检测与鉴定可以采用不同的方法。
【要点梳理】　
要点一、目的基因的获取
1、目的基因：编码蛋白质的结构基因。
2、目的基因的获取方法：①从供体细胞直接获取；②从基因文库中获取；③利用mRNA反转录形成；④利用PCR扩增技术；⑤人工合成。
3、基因文库、基因组文库、cDNA文库概念及作用：基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文库只含有一种生物的部分基因，二者都是基因文库；有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因，引入受体细胞使之表达。
4、比较几种目的基因的获取方法
方法
基因文库的构建
PCR技术扩增
人工合成
基因组文库
部分基因文库如cDNA文库
过程
供体细胞中的DNA
↓限制酶
许多DN***段
↓插入
载体
↓导入
受体菌群
（基因组文库）
↓
外源DNA扩增，产生特定性状
↓分离
目的基因
目的基因mRNA
↓逆转录
单链DNA
↓合成
双链DNA
↓插入
载体
↓导入
受体菌群
（cDNA文库）
↓分离
目的基因
目的基因DNA
↓高温解链
单链DNA
↓与引物结合、
DNA聚合酶
大量目的基因
蛋白质的氨基酸序列
↓推测
mRNA的核苷酸序列
↓推测
结构基因的核苷酸序列
↓化学合成
目的基因
优点
——
专性强
可在短时间内大量扩增目的基因
专一性强，可产生自然界中不存在的新基因
缺点
工作量大，盲目性大，专一性差
操作过程较麻烦，技术要求过高
——
适用范围狭小

5、PCR与生物体内DNA复制的比较
生物体内DNA复制
PCR
解旋
在解旋酶作用下，细胞提供能量，DNA双链部分解旋
加热至90℃～95℃时。双链全部解开，不需解旋酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72℃左右
特点
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
Taq DNA聚合酶
不需要
需要
循环次数
受生物体自身控制
30多次
相同点
生物体内的DNA复制和PCR中都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行
要点二、基因表达载体的构建
1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并再遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。

①启动子：一段有特殊结构的DN***段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别结合的部分。
②终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
③标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等