文档介绍：基因工程的基本操作程序
专题１基因工程
珠海市实验中学　周树奇
基因工程的基本操作程序主要包括
四个基本步骤：
1）目的基因的获取
2）基因表达载体的构建
3）将目的基因导入受体细胞
4）目的基因的检测与鉴定序仪：
2）PCR技术：
对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。
3）从基因文库中获取目的基因：
基因文库:
将含有某种生物不同基因的许多DN***段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library)
基因组文库:
基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.
部分基因文库:
基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.
用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶绿体DNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DN***段的细菌增多。通过分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DN***段的细菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的DN***段。建立和使用基因文库是分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位和基因工程的研究都很有用。
步骤二：基因表达载体的构建
1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。
2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。
3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
步骤三：目的基因导入受体细胞
①直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。
（1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。
（2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。
（3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。
（4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。
②间接导入法常用的载体是质粒、λ噬菌体、科斯质粒。
（1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。
（2）λ噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。
（3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和λ噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。

大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:
首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.
第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.
第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。
1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。
2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。
3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。
步骤四：目的基因的检测与鉴定
四环素
抗性基因
氨苄青霉
素抗性基因
不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。
受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？
若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。
前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。