文档介绍：中山大学
硕士学位论文
广州管圆线虫分泌蛋白基因AC16的克隆表达及免疫学鉴定
姓名:李正宇
申请学位级别:硕士
专业:病原生物学
指导教师:吴忠道
20090605
广州管圆线虫分泌蛋白基因的克隆、表达及其免疫学鉴定摘要中山大学中山医学院寄生虫学教研室业:病原生物学硕士研究生:李正宇师:吴忠道教授专导中山大学硕士学位论文◇毕钅炕鸬淖手拢U沽斯阒莨茉蚕叱娌》乐喂键技术的研究,采用表达序列标签管圆线虫成虫文库中发现了一个在插入的序列中具有信号肽的克隆,同源性分析提示该阳性克隆插入的序列与美洲钩虫谋砻嫦喙乜乖同源。为此,本研究选取该分子作进一步的研究。广州管圆线虫病且恢质笤葱约纳娌。洳≡迨枪州管圆线虫口F裎V梗澜绫ǜ娴牟±多例,年在北京地区发生了一起广州管圆线虫病群体发病事件,该病已被卫生部确定为新发传染病。人生食含有广州管圆线虫幼虫的淡水螺等中间宿主后可被感染。人是广州管圆线虫的非适宜宿主,幼虫入侵人体后一般停留在中枢神经系统绕涫悄宰橹,引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎攘俅蔡卣鳎诔人中可伴随头痛、颈部强硬、感觉异常、呕吐、恶心等症状。该病进程发展快,感染后危害性极大。因此,早期诊断和早期治疗对该病的预防治疗具有着重要的意义,发展有效的早期诊断技术也就成为了该病防治研究重点之一。本课题组在国家“,分析技术从广州
中山大学硕士学位论文◇研究目的表达,并对其免疫学特性进行了初步验证,为开展进一步对广州管圆线虫功能蛋白的研究提供实验依据。研究方法蜓』虻男蛄蟹治黾吧镅Ъ候选基因的生物信息学分析片段的核苷酸序列,经编辑后的序列通过琌⑼撇庀嘤Π被嵝蛄校缓笥肂型葱苑治觯关荾://..』虻膍B妓椒治采用对候选编码基因在不同虫期的相对表达水平进行分析。.蜓』駾和序列的差异提取广州管圆线虫的基因组院蜓』虻奶匾煨砸锝蠵,扩增得到的序列再与其序列进行比较,以此证实候选基因的蚼候选基因的克隆与表达以阳性噬茵体D0娼蠵扩增候选基因编码序列,克隆到原核表在前期工作的基础上,对可能的广州管圆线虫分泌蛋白基因进行克隆随机挑取广卅茉蚕叱娉沙鎐目獾牡ジ鍪删撸捎枚嗑勖噶捶从际趵┰龀龊蜓∈删叩牟迦肫危擞弥苯硬庑蚣际醪舛ú迦隿数据库中的查找核酸开放阅读框进行结构分析与功能预测。提取广州管圆线虫成虫以及四期幼虫总⒎醋B己铣上嘤Φ膃序列是否存在差异。Ⅱ
中山大学硕士学位论文◇重组蛋白的免疫学鉴定研究结果瓵蛐蛄械慕峁固氐序列经比较显示无差异,说明该基因为连续的基因弈诤。瓵虻目寺∮氡泶编码基因的克隆和重组表达达载体,对重组子进行诱导表达并纯化重组蛋白,并对纯化的重组蛋白进行瓸ā以制备的抗重组蛋白的多克隆抗体庖哐G为一抗进行检测,以分析自然状态下广州管圆线虫不同时期虫体该蛋白的表达。以大鼠和/∈蟮母腥狙G遄魑L秸耄灾刈榈鞍鬃魑?乖;以纯化的融合蛋白免疫小鼠制备的抗重组抗原抗血清作为探针、重组蛋白和广州管圆线虫不同发育时期的可溶性蛋白作为抗原进行以感染广州管圆线虫的大鼠和小鼠感染血清作为探针,以广州管圆线虫不同发育时期的可溶性蛋白作为抗原进行基因笮∥,。该序列与美洲钩虫的表面相关抗原相似性为%ǜ没蛟菔泵9阒莨茉蚕叱基因。的基因结构分析编码基因在广州管圆线虫不同虫期的相对转录水平分析显示,基因在成虫和四期幼虫期均有转录。的蚦根据械锹己臘的序列信息,设计锢┰鯝的全长竦媚康幕蚱尾⒍ㄏ蚩寺〉絧柿V校璓、。
中山大学硕七学位论文◇在不同时期虫体的表达分析的免疫学特性分析乖苑治庖咴苑治不同宿主的感染血清对成虫蛋白组分的免疫识别小结现的一个与美洲钩虫表面相关抗原吹墓阒莨茉蚕叱嫖粗;颉8没虻。.和分析发现在广州管圆线虫成双酶切及测序确证该目的基因克隆成功。将成功构建的重组子一经诱导,在较宽的温度和诱导浓度范围内都获得了很好的表达;对缀筒阄鲋炕闹刈楸泶锊飏进行瓸ǎ杉接肽的分子量相一致的免疫反应条带。以多抗血清为一抗识别广州管圆线虫成虫抗原⑺钠谟壮婵乖结果显示各期虫体蛋白中均识别到一大小约的条带。纯化后的重组蛋白鼙还阒莨茉蚕叱娓腥的大鼠血清所识别,在笥掖杉幻飨缘拿庖叻从μ醮跣远照血清以及广州管圆线虫感染的小鼠血清在相应的位置未识别出有蛋白条带。结果显示,小鼠抗庖哐G寰能识别⒓肮阒莨茉蚕叱嫠钠谟壮婕俺沙婵扇苄钥乖处的蛋白条带。广州管圆线虫适宜宿主大鼠的感染血清均能识别成虫和四期幼虫可溶性抗原的相应组分笥掖杉惶趺飨缘拿庖叻从Υ,而非适宜宿主小鼠的感染血清对上述抗原均不能识别。是本课题组利用已构建的广州管圆线虫成虫文库和圆叻,编码霭被岬姆置诘鞍祝げ獾鞍字实姆肿恿课。的基因蛄形A颍弈诤印Mü蚬こ碳际趸竦昧薃的重组蛋白Ⅳ
关键词:广州管圆线虫;;克隆;表达;免疫学特性中山大学硕士学位论文◇