文档介绍：中山大学
博士学位论文
广州管圆线虫Cystatin的基因克隆、重组表达及鉴定
姓名:刘玉红
申请学位级别:博士
专业:病原生物学
指导教师:吴忠道
20100603
广州管圆线虫幕蚩寺⒅刈楸泶锛凹摘要专指导老师:吴忠道教授业:病原生物学博士生:刘玉红研究目的幼虫的淡水螺而感染。自年在北京广州管圆线虫病疫情暴发以来,广州管圆的鉴定及其致病机制的报道较少。因此,嗜酸性粒细胞的浸润及其免疫病理的调节是研究重点,而虫源性分子的筛过程,如蛋白质的分解代谢、感染与免疫、肿瘤的侵袭与转移等。不仅具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性,而且还具有免疫调节活性。有关研究发现,寄生虫分泌的样分子能下调宿主的免疫反应,可能还与寄生虫与宿主的共进了一个具有特征的序列。在此基础上,我们开展了广州管圆线虫的功能研究,为阐明在寄生虫感染或寄生虫与宿主的相互作用中的精确机制提供依据。广州管圆线虫病是一种食源性寄生虫病,人因生食含有广州管圆线虫第三期线虫的研究再次引起广泛重视。但有关广州管圆线虫的基础研究如关键致病基因广卅茉蚕叱娓腥局饕R鹨允人嵝粤O赴笪V鞯闹惺嗌窬低逞字ⅲ选与鉴定是研究的热点之一。半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一类广泛存在于病毒、细菌、动植物、哺乳动物体内的蛋白酶抑制剂,参与多种生理与病理化有关。但目前还未见广州管圆线虫样分子的研究报道。本课题组在开展广州管圆线虫基因组研究时,通过对蛄械姆治觯⑾广州管圆线虫的摹冈克降、重组表达与箍定中山大学博士学位论文儿
②典型的序列特征含有保守结构域⋯半胱氨酸蛋白酶活性抑制研究方法迷谙呱镄畔⒀Х椒ǎ訟幕虮嗦胄蛄屑鞍被嵝蛄进行分析。应用技术从广州管圆线虫第四期幼虫中扩增的全编码序列,并将其克隆入载体校菇ㄔ吮泶顰闹捎枚嘀旨ǚ椒ǘ詒进行鉴定,包括半胱氨酸蛋白酶抑制活性、免疫学活性以及蛋白质谱鉴定等。方法检测在虫体的分布特点。庖連疌小鼠,获得抗拿庖哐G澹徊捎肊法测定技术对锌乖院兔庖咴约ā掷肱嘌笮∈蠊撬枥丛吹氖魍蛔聪赴昧魇较赴际跫觳么笮∈蟾骨痪奘上赴衦诱导一氧化氮产生的体外实验,并根据生物信息学预测结果,对序列中可能的与刺激产生相关的结构域进行基因定点突变,构建表达突变体蛋白的原核表达重组质粒,捎孟赴Ъ际跗兰跘耐槐涞鞍锥跃奘上赴鶱挠跋臁研究结果瓵男蛄刑卣①具有超家族成员的典型序列特征,为类。猀~砺凵显げ釧哂邪腚装彼岬鞍酶抑制活性。序列中可能存在与活性有关的基序。③在同源进化上,与线虫较为接近,而与人、大鼠和小鼠的遗传距离较远。瓵虻目寺『捅泶①在生物信息学分析的基础上,从广州管圆线虫第四期幼虫中克隆到组质粒,并进行重组表达肦狿方法检测在虫体不同时期的表达。用免疫荧光定位免疫小鼠血清中特异性抗体滴度及其抗体亚型,用訠硇偷挠跋臁并进行重组表达。结合区域广州管圆线虫的基囚克隆、霞组表达与鉴定中山大学博十学位论文
在第三期、第四期幼②构建了咝П泶锾逑担⒒竦昧司哂邪腚装彼岬鞍酌敢种苹畆的免疫学活性鉴定②庖咝∈罂刹匾煨钥固澹⒛苁侗餉挚乖包括、③流式细胞检测结果显示:受碳ず螅笫驜谋硇头肿①体外实验显示:大鼠腹腔巨噬细胞受的刺激后,②成功构建了基于相关活性位点序列中第位氨基酸残基,天冬酰胺,駻阃槐涞腁槐涮澹⒒竦昧巳员3置庖③体外实验显示:阃槐涞膔对罨男∈笤骨巨噬细胞释放的上调作用消失或者显著减弱。实验证实茿持释放活性的特异性位点。小结狙芯恐な邓竦玫墓阒莨茉蚕叱鎐粲赾易錓诘期、第谟壮婕俺沙娼锥尉斜泶铮易橹捎胮狪/原核表达系统,成功获得了具有生物学活性的可溶性具有较强的半胱氨酸蛋白酶抑制活性,且能诱导小鼠产生特异性的多克隆抗体。这些结果为深入开展的功能研究提供了全编码基因序列;结果显示虫及成虫均有表达。性的可溶性①结果显示:感染广州管圆线虫大鼠的血清不能识别腥拘∈蟮难G迥苁侗餽。幼虫及成虫抗原的相应蛋白条带淇固逖切鸵訧龈呶V鳎浯挝狪和无明显变化,小鼠的表型分子表达明显增加∟畆对巨噬细胞产生的影响无明显变化;而小鼠腹腔巨噬细胞受碳ず螅琋棵飨陨调。学活性的突变型特异性不明显。广州管厕线虫的皋冈克降、重组表达与鉴定中山大学博士学位论文
芯糠⑾郑孩俑腥続拇笫笱G宀荒苁侗餽,而感染的小鼠血清能识别虎谑躵刺激后,大鼠的表型分子无明显变化,小鼠的表型分子表达明显增加;⑨艽俳∈蟾骨痪噬细胞在饔孟碌腘源笫蟮淖饔貌幻飨浴=峁崾荆笮∈蠖的免疫应答存在明显差异,这种差异可能与大小鼠对寄生的适应性在序列中存在与罨木奘上赴鸑喙氐墓δ域或基元,阌胛指霉δ苡虻墓δ芟喙亍本研究结果表明,是一个可能与宿主对广州管圆线虫免疫应答相关的虫源性关键分子,值得进一步深入研究。关键词:广州管圆线虫;免疫学活性;一氧化氮;功能域本论文获国家重点基础研究发展计划嗪牛、国家高技术研究发展计划嗪牛和中台项目嗪牛实验条件。差异有关。手广州管圃线虫的基因克隆