文档介绍：上海交通大学
硕士学位论文
RNA干扰PNAS-2后U937细胞凋亡及细胞周期变化的研究
姓名:肖菲
申请学位级别:硕士
专业:内科血液学
指导教师:陈芳源
20070401
RNA 干扰 PNAS-2 后 U937 细胞凋亡及细胞周期变化的研究

摘要

第一部分:利用基因芯片分析 RNA 干扰 PNAS-2 后 U937 细胞凋亡相关基因表
达的变化
目的采用基因芯片技术比较 RNA 干扰法封闭 U937 细胞中 PNAS-2 基因后与凋
亡有关基因的变化情况,从而了解 PNAS-2 在凋亡通路中的可能定位。
方法急性单核细胞白血病细胞株 U937 分别转染已构建的靶向封闭 PNAS-2
的干扰组质粒和对照组质粒,合并使用流式细胞仪筛选出 GFP 阳性细胞。半定
量 PCR 及 Realtime PCR 方法验证 RNAi 效果。采用 affymetrix u133A
genechip 及技术比较两组细胞间基因表达的差异。进一步通过半定量 RT-PCR
对其中的 2 条上调基因(IER3 、CCL2)和 6 条下调基因(CASP8、CD74、VEGF、
DNASE2、PRTN3、TERT)的表达情况进行验证。
结果半定量及 Realtime PCR 表明合并使用 G418 及流式细胞仪筛选后得到的
转染细胞在 90%以上,干扰质粒组对 PNAS-2 的抑制率达到 70%以上;基因芯
片筛选结果提示共有 1651 条出现上调,1404 条出现下调。其中比值>=2 倍的
共有 336 条,上调 114 条,下调 222 条。根据功能分类初步筛选出与凋亡相关
的基因共 23 条,上调 11 条,下调 12 条。进一步 RT-PCR 验证结果与基因芯
片结果全部符合,证实基因芯片结果可靠。
结论抑制 PNAS-2 表达后促进 U937 细胞凋亡的机制可能与 c-jun 过表达,JNK
通路的激活导致 caspase3、6 的活化而促进凋亡的发生,VEGF 基因下调可能
参与其中。而作为内源性凋亡通路启动者 Caspases8 和外源性凋亡通路启动者
Caspases9 均无变化,推测抑制 PNAS-2 表达后凋亡的上调并不通过经典的内
源性和外源性凋亡通路。
第二部分 RNA 干扰 PNAS-2 后 U937 细胞的细胞周期变化分析
实验一利用流式细胞仪和基因芯片分析 RNA 干扰 PNAS-2 后 U937 细胞的细
胞周期变化
目的采用流式细胞仪和基因芯片技术比较 RNA 干扰法封闭 U937 细胞中
PNAS-2 基因后与细胞周期有关的变化情况,从而了解 PNAS-2 在细胞周期通路
中的可能发挥的作用。
方法急性单核细胞白血病细胞株 U937 分别转染已构建的靶向封闭 PNAS-2
的干扰组质粒和对照质粒组组质粒,使用流式细胞仪分析干扰组和对照组细
胞周期的变化。采用 affymetrix u133A genechip 及技术比较两组细胞
间基因表达的差异。
结果流式细胞仪检测见干扰组细胞出现 G2/M 期的阻滞,差异有统计学意
义;基因芯片筛选结果提示共有 1651 条出现上调,1404 条出现下调。其中
比值>=2 倍的共有 336 条,上调 114 条,下调 222 条。根据功能分类初步筛
选出细胞周期相关的基因共 20 条,上调 12 条,下调 8 条。
结论抑制 PNAS-2 表达后细胞出现 G2/M 期的阻滞可导致凋亡的上升;细胞
周期素 cyclinD、 cyclinE、转录因子 E2F 的上调可以使细胞 G1 期到 S 期加
速变化;cyclin A 表达上调,cyclin B 表达下调可能是细胞 G2/M 期阻滞的
原因,ATM 基因可调控 DNA 损伤修复,它的下调也可能参与了细胞周期的阻
滞过程。
实验二利用蛋白质芯片技术检测 RNA 干扰 PNAS-2 后 U937 细胞的细胞周期
相关蛋白质表达的变化
目的采用蛋白质芯片技术比较 RNA 干扰法封闭 U937 细胞后 PNAS-2 蛋白质水
平后与细胞周期有关的变化情况,从而了解 PNAS-2 在细胞周期通路中的可能
发挥的作用。
方法急性单核细胞白血病细胞株 U937 分别转染已构建的靶向封闭 PNAS-2
的干扰组质粒和对照组质粒。采用蛋白质芯片及技术比较干扰组和对照组细
胞间蛋白质水平表达的差异。
结果蛋白质芯片筛选结果提示共检测有 720 条蛋白质。有 266 条出现
倍以上的上调变化(37 %),有 103 条出现倍以上的下调变化(14%)。
其中与细胞