文档介绍：汕头大学
硕士学位论文
小鼠IL-33的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与应用研究
姓名:柳晓金
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:李明才
2010-05
汕头大学医学院硕士学位论文
中文摘要

白细胞介素(IL)-33 是 2005 年 Schmitz 等使用计算机序列分析、发现并鉴定的一种前炎
症细胞因子。它的基因序列和结构与 IL-1 家族成员 IL-1β和 IL-18 最为相似,属于 IL-1 家
族的一个新成员,也被称为 IL-1F11。IL-33 mRNA 在小鼠胃、肺、脊髓、脑、皮肤等组织
及静止树突状细胞、活化的巨噬细胞高表达,在人平滑肌细胞及支气管或小气道上皮细胞
为组成性表达。IL-33 与其受体 ST2 结合,活化核因子(NF)-κB 和丝裂原激活的蛋白激酶
(MAPK),诱导辅助性 T 细胞(Th)2 细胞因子的产生,在多种炎症与免疫过程中发挥重要作
用。
目前,关于 IL-33 功能的研究在国内外都尚处于发展阶段。本研究用分子生物学技术
克隆小鼠 IL-33 基因,通过构建其真核及原核表达载体、原核表达系统表达 IL-33 蛋白及
其兔抗多克隆抗体的制备,探讨小鼠 IL-33 蛋白在不同组织中的表达分布及 IL-33 在不同
疾病动物模型中的作用,为进一步研究其功能奠定了基础。本文主要研究内容如下:
一、根据 GenBank 中小鼠 IL-33 基因序列(No. AY905582)设计特异性引物,用逆转录-
多聚酶链反应(RT-PCR)技术,克隆出 IL-33 基因的全长编码区。将其克隆入 (+)
载体,构建其真核表达载体 (+)-mIL-33,之后将该表达载体转化入大肠杆菌
TOP10 中,经菌落 PCR、酶切鉴定及序列测序,得知它与 GenBank 中的序列完全一致,
为 IL-33 基因的表达研究奠定了基础。
二、根据小鼠 IL-33 基因序列设计特异性引物,用 PCR 技术,克隆出 IL-33 成熟蛋白
编码区,将其克隆入载体 pET-44,构建原核表达载体 pET-44-mIL-33,经测序鉴定其编码
基因与 GenBank 中的序列一致。将该表达载体转化入大肠杆菌 BL21(DE3)中获得表达菌株,
然后在 25°C 用 IPTG 诱导,表达的融合蛋白以可溶性蛋白及包涵体形式存在。用镍离子亲
和层析法纯化以可溶性形式存在的目的蛋白,经凝胶图像分析确定其纯度可高达 95%以上。
细胞增殖实验结果表明,重组 IL-33 蛋白具有抑制细胞增殖的活性,且其活性比标准品高。
三、利用纯化的 IL-33 蛋白,免疫新西兰白兔,制备兔抗小鼠 IL-33 多克隆抗体, ELISA
结果显示,该多克隆抗体效价高达 1:32 000;Western blot 结果显示,该多克隆抗体可以与
小鼠 IL-33 蛋白特异性结合。免疫组织化学染色结果显示,小鼠 IL-33 蛋白分布于支气管
上皮细胞及肝细胞的细胞质或细胞核中。
四、在 IL-33 与类风湿关节炎关系的研究中发现,抗 IL-33 多克隆抗体可减轻关节炎
体征及关节腔内炎症细胞的浸润。
I
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总之,IL-33 基因的克隆、成熟蛋白的原核表达、多克隆抗体的制备及对 IL-33 与类风
湿性关节炎等炎症与免疫性疾病关系的初步探讨,为进一步进行 IL-33 的理论研究及临床
应用研究奠定了基础。

关键词白细胞介素-33;基因克隆;表达;多克隆抗体;类风湿性关节炎

II
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Abstract

Interleukin (IL)-33, also called IL-1F11, first described as a proinflammatory cytokine in
2005 through putationally derived profile of members of the IL-1 cytokine family, belongs
to IL-1 family, and is most closely related in structure to IL-18 and IL-1β. IL-33 mRNA is
broadly expressed in many tissues of human and mouse, but it is more rest