文档介绍：华中科技大学
博士学位论文
脂氧素A4抗肝癌作用及机制研究
姓名:郝华
申请学位级别:博士
专业:病理学与病理生理学
指导教师:叶笃筠
2011-05
华中科技大学博士学位论文

中文摘要

第一部分脂氧素 A4 抑制肝癌细胞的 EMT、增殖、迁移、
血管新生和转移及促凋亡作用

实验背景
大量的研究结果表明,慢性炎症与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。而当前
肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,生长快,转移早,死亡率高。肝癌与慢性
肝炎密切相关已经为人们所熟知,所以肿瘤炎症微环境成为当前炎症相关肿瘤研
究的热点。而肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是肿瘤
炎症微环境中的重要组成部分,在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色。
脂氧素(Lipoxin,LX)被形象地称为炎症过程中的刹车信号,通过跨细胞
途径由花生四烯酸合成,是体内最重要的抗炎促消退介质之一。我们课题组的前
期研究结果已经证实,脂氧素 A4(LXA4)能够抑制小鼠巨噬细胞系
和 HepG2 细胞内的核因子-κB(nuclear factor, NF-κB)的活性,这为我们研究 LXA4
的抗肝癌作用提供了依据。

实验目的
体外实验研究 LXA4 对人肝癌细胞(HepG2)epithelial-mesenchymal transition
(EMT)、凋亡、增殖、迁移、血管新生的影响及其机制;体内实验通过构建 H22
荷瘤小鼠模型,研究 LXA4 类似物 BML-111 对原发瘤增殖,血管新生,炎细胞
浸润,侵袭及转移的影响及其机制。

实验方法
采用脂多糖(haride, LPS)和激活巨噬细胞上清液(activated
macrophage-conditioned media,ACM)分别体外模拟炎症微环境模型,分别通
过 HE 染色,免疫荧光,western blotting 及 RT-PCR 检测 LXA4 对 HepG2 细胞 EMT
转变的影响;通过 Hoechst 染色、免疫荧光和流式细胞检测 LXA4 对 HepG2 细胞
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凋亡的影响;MTT、RT-PCR 和 western blotting 观察 LXA4 对 HepG2 细胞增殖
的影响及其机制;伤口愈合实验观察 LXA4 对 HepG2 细胞迁移的影响;ELISA
法检测 LXA4 对 HepG2 细胞上清液中内皮细胞生长因子(VEGF)的影响;体内
实验观察 BML-111 对 H22 荷瘤小鼠原发瘤细胞侵袭,血管新生,凋亡,增殖,
炎细胞浸润及肿瘤转移的影响及其机制。

实验结果
1. LXA4 能有效抑制 LPS 诱导 HepG2 细胞发生 EMT 转变。HE 形态观察,LPS
刺激后,细胞排列松散,加入 LXA4 干预后,细胞恢复上皮细胞的紧密连接。
脂氧素受体(FPRL1 受体)阻断剂 Boc-2 能部分阻断这种作用,细胞形态介
于 LPS 组和 LPS+ LXA4 组之间。同时免疫荧光检测发现,LPS 刺激后,上
皮性标记 E-cadherin 明显减弱,P53 负性调节 E-cadherin,而间叶性标记
Vimentin 和 Fibronectin 明显增强。而加入 LXA4 干预后,E-cadherin 的表达
明显增强,Vimentin 和 Fibronectin 明显减弱,Boc-2 能部分阻断这种作用。
Western blotting 结果同免疫荧光结果,而调控 EMT 的关键基因 Slug 和 Twist
在 LPS 刺激后上调,加入 LXA4 后明显下调。
2. LXA4 促进 HepG2 细胞凋亡。LPS 刺激后,HepG2 细胞凋亡减少,Bcl-2 表
达增强,而加入 LXA4 干预后,HepG2 细胞凋亡明显增多,同时 Bcl-2 表达
减弱。流式细胞检测细胞周期发现,50nM 的 LXA4 能有效促进 HepG2 细胞
凋亡。
3. LXA4 能有效抑制 LPS 诱导的 HepG2 细胞的增殖。 MTT 结果显示 100,200,
400nM 的 LXA4 均能有效抑制 LPS 诱导的 HepG2 细胞的增殖。我们同时检
测了增殖指标核仁素(C23)和调控蛋白核干素(nucleostemin,NS)的表达
变化。免疫荧光、RT-PCR 和 western blotting 结果发现 LXA4 能有效抑制 C23
和 NS 的表达,并且呈