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目录摘要第一部分姿峄鞍字始觳夥椒ǖ慕结果与讨论第二部分姿峄鞍字始觳夥椒ǖ奶卣餮芯材料与方法参考文献学位论文独创性声明前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯附录致谢综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯,⒔⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯温州医学院硕士学位论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··
:芯靠7⒖焖佟⒘槊簟⒀≡裥郧康牧姿峄鞍字始觳夥椒ǎA姿峄鞍字首檠а芯咳嗽碧峁┖鲜实娜旧ǚ椒ā方法:肧瓵染料,对应用该染料的原始磷酸化蛋白质检测方法进行改进,考察影响染色效果的各个因素,包括染料浓度,染色液溶剂组成、染色时间等;增加显色步骤,提高染色灵敏度,建立简便、快速、灵敏、选择性强的检测方法。捎镁郾0纺旱缬甈分别分离标准蛋白、动物组织样品和磷酸酶处理前后的酪蛋白,将所得凝胶用至姿峄鞍字始觳夥椒ǚ直进行染色,比较这些方法的选择性、灵敏度、线性范围等信息。弥势准际踅徊窖橹じ慕腟瓵磷酸化蛋白质检测的专属性。结果:栽嫉腟瓵磷酸化蛋白质检测方法即瓵ń辛烁进,成功建立新型的磷酸化蛋白质检测方法即法,操作步骤如下:矗航ǖ缬竞蟮木郾0纺褐糜0分兴次,每次潞驼褚。旧ǎ航褐糜谌旧瓵,%甲酰胺,腥旧陨ǎ航褐糜谙陨,%乙醇邢陨玪ü种方法法、法、甉的比较,显示ǖ灵敏度达到.,优于法,与甉ㄏ嗟保谎≡裥苑面,实验结果显示ǘ粤姿峄鞍字视辛己玫难≡裥裕ü势准际踉谛∈笮募〉榷镒橹哪荷霞觳獾搅隽姿峄鞍质、个磷酸化位点,进一步证明了ǘ粤姿峄鞍字始觳獾淖ㄊ·..琾
结论:ň哂胁僮骷虮恪⒖焖佟⒀≡裥郧俊⒘槊舳雀叩挠诺悖槊舳却锏.,操作时间仅需并对磷酸化蛋白质表现出了良好的选择性,适用于当前的磷酸化蛋白质组学研究。关键词:磷酸化蛋白质;.籌;甉痪郾0纺旱泳
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前言蛋白质磷酸化是真核细胞中最重要的翻译后修饰方式之一,与细胞分化、增殖、发育、凋亡、信号转导等许多生命活动密切相关,其中磷酸化过程多发生在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等氨基酸上,俊R虼耍粤姿峄痰鹘谧饔玫研究就显得至关重要,也使磷酸化发生方式、作用位点等成为了研究的热点之一,越来越引起蛋白质组学家的注意。众所周知,聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种广泛使用的用于分离蛋白质的技术。通常利用电泳结合凝胶上磷酸化蛋白质特异性染色方法来鉴别磷酸化蛋白质,现将比较常用的几种磷酸化蛋白质染色技术介绍如下:甉旧ǚㄊ悄壳坝糜诘缬竞竽荷霞觳饬姿峄鞍字实娜旧ǚ法中最为常用的方法,该染料是美国公司生产的一种商业化产品。该技术是凝胶上磷酸化蛋白质检测领域的一个突破性进展,克服了以往磷酸化蛋白质染色法灵敏度低,选择性差的缺点,并且能够直接检测磷酸化位点位于丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸上的磷酸化蛋白质,不需要复杂的样品处理过程。但是该产品价格昂贵,严重限制了它在高通量蛋白质组学领域的应用。.且恢盅衾胱郁驶ㄇ嗳玖其结构式如图,该染料也可用于磷酸化蛋白质检测【】。染料与磷酸化蛋白质结合时呈蓝色,与非磷酸化蛋白质结合呈红色,可见光下即可通过颜色的差别将磷酸化蛋白质检测出来。这种双重染色的特性能使研究者从单一的实验步骤中获得更多的信息,降低操作强度。但该方法也有明显的缺点:首先,染色法的线性范围很小,因而很难满足蛋白质组学定量分析的要求。其次,染色法灵敏度低,检测时需要的蛋白质样品量大。第三,染料对于光照敏感,染色过程需要进行避光处理,以防止染料降解,增大了操作的难度及复杂性。图甋瓵染料结构式温州医学院硕士学位论文
姿峄鞍准觳馐约梁幸部捎糜诹姿峄鞍字始觳猓芴匾性地检测丝氨酸、苏氨酸氨基酸上的磷酸化。该方法的原理是丝氨酸、苏氨酸上的磷酸酯的加碱水化后产生无机的磷钼酸根,然后与染料缂谆獭⒖兹绿、罗丹明康产生沉淀从而将磷酸化蛋白质检测出来。由于磷酸化酪氨酸在碱性条件不能发生水解作用,在该位点上发生磷酸化的蛋白质不能应用该方法检测。此外,该方法的灵敏度也十分有限,,但也都有明显的缺点,不能完全满足高通量磷酸化蛋白质组学的需求。本文选用染料,对原方法进行改进,以期达到操作简便、灵敏度高、选择性强的目标。温州医学院硕士学位论文
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