文档介绍：克隆重组技术
原理
先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,进行繁殖和表达。
一、质粒载体
二、大肠杆菌、农杆菌
三、热激转化技术、电激转化技术
四、质粒的提取及纯化
五、克隆重组技术的操作流程
一、质粒载体
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒可分为紧密控制型和松驰控制型。
理想的克隆载体
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:
分子量小、多拷贝、松驰控制型;
具有多种常用的限制性内切酶的单切点;
能插入较大的外源DNA片段;
具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间,如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
克隆载体
二、大肠杆菌、农杆菌
培养基:
LB液体培养基(培养大肠杆菌):25g/l;pH
LB固体培养基:液体培养基中加15 g/l不透明琼脂
YEB液体培养基(培养农杆菌): g/l
蛋白胨 g/l
牛肉膏 g/l
蔗糖 g/l
硫酸镁 g/l
pH ~
YEB固体培养基:液体培养基中加10~12 g/l不透明琼脂。
抗生素:
抗生素
浓度
保存条件
工作浓度
氨苄青霉素(Amp)
50mg/ml(溶于水)
-20℃
50μg/ml
卡那霉素(Kan)
100 mg/ml(溶于水)
-20℃
50μg/ml
氯霉素(Chl)
15mg/ml(溶于酒精)
-20℃
15μg/ml
感受态细胞
在人工构建的质粒载体中,将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
大肠杆菌可制备热激、电激两种感受态细胞。农杆菌因为转化效率比较低,所以只制备电激两种感受态细胞。
三、热激转化技术、电激转化技术
热激转化技术:
1、取出-84℃保存的大肠杆菌热激感受态细胞冰上溶化3min,加入适量的连接产物或纯质粒,枪头轻轻吸放混匀。
2、冰浴30min;42℃循环水浴90S;冰浴3~5min。
3、无菌操作加入800μl LB 液体培养基(不含抗生素)。150rpm,37℃,30min;280 rpm,37℃,30min。
4、将转化后的感受态细胞涂板,100μl、200μl、600μl各一板,过夜培养(倒置培养基)。