文档介绍：第23章细胞的大量培养
•因实验室采用的细胞培养技术获得的细
胞量有限,不能满足生产的需求,必须
改用超产培养技术方可获得大量细胞,
目前这种技术种类繁多,归纳起来有三
大类:(1)单层静置贴壁培养法;(2)悬浮
培养法;(3)固定化培养法。
•一、单层静置贴壁培养法:转管及转瓶培养和
旋转园柱管培养
•二、悬浮培养法: (1)翻滚培养(2)旋转
培养(3)电磁搅拌培养(4)振荡培养(5
)振动器培养(6)滋养器装置(7)发酵罐
培养(包括搅拌生物反应器和气动发酵器培
养)
•三、固定化培养法: (一)多层培养:
层繁殖器;;
养系统;;-cel薄
膜卷带式培养(二)微载体培养(三)中
空纤维灌注培养(四)玻璃珠床培养(五)
包被细胞培养(如图)
第一节培养要素控制及其参数的
测定
•一、细胞的定量测定
•(一)细胞数量的测定: 结晶紫或台盼兰染色法
•(二)细胞活性的测定
•1、直接测定:台盼兰染色法测计存活率MTT
法或3H-TdR掺入法可显示细胞的代谢状态和
生长繁殖的活力。
•2、间接测定:(1)葡萄糖的利用(2)乳酸
或丙酮酸代谢产物量
•(三)培养要素控制
•1、容器生长表面的选择和处理(静置贴壁培养)
•应选用明矾-硅硼酸钠玻璃(例如Pyrex);塑料
表面常用聚苯乙烯,此外还可用聚乙烯多聚碳
酸盐、Perspex、PVC聚四氟乙烯(Teflon)玻
璃纸及醋酸纤维素等;不锈钢(但处理和清洗时
要用酸洗(10%硝酸、%氟氢酸、%水)
以利除去表面污物
•2、悬浮培养基中的添加剂
•保护剂:羟甲基纤维钠(纤维素) ;消泡剂:硅
油/pluronic F
•3、培养条件:(1)温度适宜温度为37℃,
通常选择36℃± (2)pH 理想的pH值为
(3)细胞生长期的选择应选择对数生长
期的细胞接种培养(4)接种细胞密度:指导
浓度为5×104~2×105细胞/mL或5×103~
2×104细胞/mL。(5)搅拌速度:可用100
~500r/min,通常为200~350r/min,微载
体培养在20~100r/min
•4、培养基和营养物质的选择
•常用Eagle(BME或MEM)加2~5%小牛血
清,但谷氨酰胺需不断补充,同时可补
充胱氨酸、精氨酸,胰岛素(5mg/L)
、转铁蛋白(5~35mg/L)、胆胺(
20μmol/L)及硒(5μg/L)等,Ca++
、Mg++应尽量降低,以防细胞结团、贴
壁、下沉,也可采用补加胰蛋白酶(
2mg/L)可以克服。
•5、培养系统的控制
•(1) pH调控系统:PH探头ÆPH显示Æ调空
板Æ滴加酸碱; 的比例来调节
5%CO2/95%O2
pH ;加入Hepes。
•(2)通气调控系统:Roux瓶静置培养(
10:1)溶解氧(表23-1 );在40L生物反应
器试验中扩散+灌注培养可获得高密度细胞(
如表3-2)
•(3)通过测定氧化还原势能(ORP),可监
控细胞生长动态及对数生长期(如图23-2)
表23-1 Roux培养瓶气相和液相氧的浓度
在900ML空瓶中的氧 900××32/22400=
在100ML培养液中的氧
100××10-4=
注: 32=氧的分子量
22400为克分子数,×10-4为氧与空气平衡时37℃
水中氧的溶解度。