文档介绍：生物技术制药实验
武汉大学药学院 生物技术实验室
湖北·武汉
目 录
实验一 质粒 DNA 的小量制备 ·················································································· 2
实验二 质粒 DNA 电泳鉴定 ··················································································· 4
实验三 感受态细胞的制备和转化 ············································································ 5
实验四 目的基因的表达及表达产物的初步提取 ·························································· 8
实验五 蛋白质纯化—盐析沉淀法 ·········································································· 10
实验六 凝胶过滤层析 · ························································································ 14
实验七 蛋白质免疫印迹实验（Western Blotting） ······················································· 16
实验八 HRP 结合物的过碘酸钠交联法 ····································································· 19
1
实验一 质粒 DNA 的小量制备
【目的】
学会最常用的碱裂解法小量制备质粒 DNA 的方法。
【原理】
根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性 DNA 在拓扑学上的差异来分离。在
这个狭窄的范围内，线性DNA 双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的条件下共价闭
合环状质粒 DNA 也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加
入 的乙酸钾高盐缓冲液使 pH 恢复中性时，共价闭合环状质粒 DNA 复性快，而
线性的染色体 DNA 复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子 RNA 等发生共沉淀下去而
被去除。
【器材】
超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液器， 微量离
心管，恒温摇床，试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
【试剂】
pET-28a 质粒载体菌, LB 培养基 1000ml（含 10g/ml 卡那霉素），葡萄糖/Tris/EDTA 溶
液（溶液 I），NaOH/SDS 溶液 （溶液 II），KAc 溶液（）（溶液 III），RNase A，
95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（）。
【实验准备】
1. 配制卡那霉素储存液（无菌水配制 10mg/ml，分装后-20C 保存）。
2. 配制 LB 培养基
（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g 加 200mL 双蒸水搅拌完全溶解，用约
200L 5N NaOH 调 pH 至 ，加双蒸水至 1L，121C 灭菌 20min）。
3. 溶液 I（50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris HCl ，10mmol/L