文档介绍：湖南医科大学
博士学位论文
双随体小染色体功能元件的研究及小染色体同源区域-D、G组染
色体短臂处源基因的表达研究
姓名:黄蕾
申请学位级别:博士
专业:医学遗传学
指导教师:夏家辉
双随体小染色体功能元件的研究及小染色体同源区域..、槿旧宥瘫弁庠椿虻谋泶镅芯中文摘要危害,萨好符合基因治疗载体的要求孀湃死嗷蜃榧苹目焖俳梗嚼丛蕉嗟娜死嘁糯ú『椭琢龌肄性片段构建了组染色体短臂导向的基因打靶载体一人源性基因载体小仅有可能是一种理想的基因治疗载体,而且是人类在体细胞和离体短臂的安全靶位点,外源基因的有效、稳定表达,/证明了人源性基因体细胞基因表达研究及基因工程产品丌发的有效工具瓸δ茉<幕竦眉捌湫蛄刑匦苑治赴糯а芯恐っ鳎築鹪从湃旧宥瘫郏⒂隓、染色体短臂同源静糠盅芯客ü目馍秆』竦昧薆隓、槿旧体短臂同源的卧,并对其进行亚克隆测序及序列特性分析,以期为治疗基因定点插入提供安全、有效的靶位点。/同时,对获得因被克隆,从基因水平上对遗传病和肿瘤进行治疗已成为医学发展的必然趋势和人类健康的迫切需求。而基因治疗面临的最关键的问题就是基吲导入系统即载体问题,目前使用较多的病毒性基因治疗载体普遍存在遗传晃榷ā⑷萘啃踩圆罴懊庖咴缘热毕荨6斯と旧逡参能解决安全性及体外操作等问题。因此,寻找一种能稳定遗传、对人体尢仟何危害、容量足够大又便于体外操作的新载体已成为当夯蛑瘟本室夏家辉院士于年在两个『H思蚁抵蟹⑾值乃嫣逍∪旧体不仅能独立于条染色体之外稳定遗传,而且对人体无任何狙芯恳訠2牧希环矫娑其功能元件的序列特性进行了分析,为进一步利用功能元件构建便逋獠僮鞯娜死嗳斯の⑷旧搴脱罢野踩ǖ幕虻既胛坏愦蛳铝嘶础:另一方面根据来源于组染色体短臂的特点,利用特载体,并成功地利用陔载体将外源基因定点导入基因组中组染色的号染色体着丝粒癇葱蛄薪辛私峁购凸δ芊治觥6的核心问题。博士学位论文黄蕾,
嘶蜃镈的寺猒,通过,陔部分研究在对特异性片段序列特性分析的基础上,,并已将序列输入邮蘸盼①这两部分可能具备人工染色体所需的复制起点功能和着丝粒功②的区域不含与已知重要生理功能相关的基因,是基因瓸辞颉N鳌组染色体短臂外源基因的表达研究组染色体短臂同源的特点,以的特异性片段基谢妥橹拖巳苊冈せ罴粱成功地定点导入利用功能元件体内或体外构建用于基因治疗的人类人工微染色体目尚行越辛顺醪教教帧利用显微切割、⑽⒖寺〖、杂交、测序及数据库分析获得特异性的单拷贝序列,并以此单拷贝为探针筛选人基因组目猓竦靡缓杂交及鉴定,证明来源于并与组染色体短臂同源。同时从菘獠檠安⒒竦湃旧遄潘苛先后选用訮忻盖校⒀强寺≈羛质⒏粗破鹗嫉愕确矫娴姆治觥⒃げ猓峁砻鱌缓知的椭匾I砘疃喙氐幕蛟亩量颍赡芎懈粗破鹗嫉恪M时通过对进行咏患把强寺〔庑蜓芯浚っ髌阂S赡芏懒⑻峁┳潘苛9δ艿腶卫星槌伞总之,通过该部分的研究,获得了和组染色体特异性片段和着丝粒蛄刑匦苑治霰砻鳎导入的安全靶位点。为基因打靶引导序列构建了基因打靶载体,并利用该载体将凝血因子槿旧宥瘫鄣陌踩颍⒂行А⑽榷ū泶铮饩隽薆掷肽选重组难、转移难的问题,为该打靶载体用于基因治疗临床试验提供了实寺粒,用步移法测序,共完成。利用砑訮蛄薪蠩、丌放阅读框能,可做为人工微染色体的功能元件。博士学位论文黄蕾验依据。
切除馗矗栽靥褰辛烁脑欤纬闪宋榷ǖ膒虬性靥濉!总之冉本研究探讨了功能元件用于体内、体外构建人类人工微冉饩隽薆逋獠僮髂训奈侍猓纸饩隽说苯窕蛑瘟圃靥宓囊糯ǖ螅两同源臂中有重复序列,相似性高达%以上,推测载体的不要生理功能相关基因的区域一组染色体短臂并稳定、有效表达。稳定,随机插入突变、免疫原性等问题,为基因治疗研究提供了新思路,性/M粗刈橐夹蛄校屑洳迦搿篎筛选基因颍菇酥没恍突虼虬性靥濉NA私瘟苹虻既朐靥澹分别先后采用了挚寺⊥庠椿虻穆废撸褐苯硬迦搿⑶谐糠滞幢因后载体不能稳定复制。通过打靶载体各元件的相似性的比较分析发现,稳定性可能是由于环状质粒复制时蛄刑攴⑸粗刈樗隆Mü并将疶连入打靶载体,酶切、测序鉴定证明获得阳性克隆,再扩增试验证明含外源基因的载体在菌株中能稳定复制,证实了以上推将含拇虬性靥狥秃琓的打靶载体—负筛选,获得定点整合的阳性细胞克隆,峁砻鳎現、甈确实定点整合到组染色体短臂上,并且在阳性细咆瑃降中无随机经合的发生。活性测定结果显示,外源基因插入组染色体短臂同源区域后能稳定、有效表达。孩研究结果表明:的同源区域不仅是基因打靶的安全靶位点,而且是外源基因稳定表达的有效靶位点。⑼北狙芯炕狗⑾以为同源重组引导序列构建打靶载体时应尽量避免相似或相同的序列在同一载体上存在。染色体的可行性,同时利用特异性片段成功地构建了能稳定复制的基因打靶载体,实验证明该载体能将外源基因定