文档介绍：上海交通大学
硕士学位论文
神经母细胞瘤细胞鉴定与微小残留病检测研究
姓名:蔡娇阳
申请学位级别:硕士
专业:儿科学(血液肿瘤)
指导教师:汤静燕
20070415
神经母细胞瘤细胞鉴定与微小残留病检测研究

摘要

目的
阐明神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)骨髓微量肿瘤病灶(minimal residual
disease, MRD)检测方法及结果对预后的影响;建立NB骨髓转移细胞的体外培养与
鉴定实验方法。
方法
1、应用CD45-FITC/CD81-PE/CD56-PECy5单抗组合通过流式细胞术(flow
cytometry, FCM)检测了人NB细胞株TGW的免疫表型并确定本实验室FCM的敏感度
为1×10-4;比较Ⅲ~Ⅳ期NB患儿治疗前及治疗中骨髓细胞形态学检查与FCM检测
BM中的CD45-/ CD81+/ CD56+细胞阳性率;通过对NB患儿治疗前及治疗不同阶段的
BM MRD检测分析其应用价值。
2、应用荧光定量多聚酶链反应法(fluorescent quantitation-polymerase chain
reaction,FQ-PCR)检测骨髓微量神经母细胞瘤细胞的酪氨酸羟化酶(Tyrosine
hydroxylase, TH)表达,建立了以TH为靶基因FQ-PCR方法检测微量神经母细胞瘤细胞
的方法。共检测临床NB标本26例,其中包括24例骨髓标本,1例胸水标本和1例干细
胞采集物,阴性对照为5例正常儿童和11例非神经母细胞瘤患儿骨髓。
3、我院血液科门诊及病房伴骨髓转移的NB患儿共17例,经骨髓穿刺发现NB细胞
及病理确诊,患儿骨髓中瘤细胞镜检比例50-80%。无菌条件下取NB骨髓转移患者骨
髓,用Ficoll分离单个核细胞,加入含有双抗(青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml)
的20%胎牛血清DMEM/F12培养液中,接种于6孔培养板中5%C02, 37℃培养。在倒置
相差显微镜下观察细胞生长情况及形态学特点,同时分别应用FCM检测CD45-/
CD81+/ CD56+的表达、FQ-PCR方法检测TH的表达及免疫组化方法对原代培养的NB
骨髓转移细胞进行鉴定。
结果
1、比较了 35 例初诊时 FCM 检测 BM MRD 阳性患儿平均化疗 4 个疗程后 MRD
结果与预后关系,化疗 4 个疗程后 15 例患儿 MRD 转阴,其中 5 例复发,其余 10
例随访至今无复发及进展,无瘤生存平均时间个月;另外 20 例患儿化疗 4 个
疗程后 MRD 仍为阳性,其中 10 例患儿复发或进展,包括 1 例死亡,两组差异有统
计学意义。比较了化疗后移植患儿外周血干细胞(peripheral blood stem cell, PBSC)
采集前骨髓 MRD 结果与预后的相关性:共有 24 例患儿接受化疗后行外周血干细胞
移植,18 例患儿采集 PBSC 时骨髓 MRD 为阴性,其中 5 例患儿复发,自移植后始
DFS 平均时间个月;6 例患儿采集 PBSC 时骨髓 MRD 为阳性,5 例复发,两
组差异有统计学意义。
2、通过倍比稀释NB细胞于正常骨髓单个核细胞中,本文确定了FQ-PCR法的敏
感性为1×10-5,即可检测到105个正常骨髓细胞中的一个肿瘤细胞。26例NB标本中阳
性24例,阴性2例。阳性对照TGW细胞株表达TH;阴性对照组非肿瘤患儿和其他实
体瘤患儿骨髓标本均不表达TH。相同的标本同时行骨髓细胞学检查及FCM检测,
FQ-%,FQ-PCR结果阳性者细胞学检查和FCM(%)结果均为
阳性。
3、我们对17例骨髓转移的NB患者进行NB骨髓转移细胞体外原代培养,传代超过
15代有5例,其中2例超过20代,经FCM、FQ-PCR方法、免疫组化鉴定为NB细胞,
最终细胞因反复传代失去强增殖能力。
结论
1、运用 FCM 检测 NB 患儿 BM 中的 MRD 敏感度高、特异性强,可协助初诊
NB 患儿的诊断、评估临床疗效,BM 中 MRD 残留与神经母细胞瘤预后相关.
2、FQ-PCR方法较FCM法敏感,可以用于治疗过程中监测MRD,指导治疗,影
响预后,具有临床应用价值。
3、本实验建立 NB 骨髓转移细胞体外原代培养的实验技术,为将来建系提供了
良好的实验基础与经验,为 NB 体外诱导逆转及多药耐药等复杂机制研究提供更接
近体内生物学性状的细胞来源。

关键词神经母细胞瘤,流式细胞仪,微量残留病灶,荧光定量多聚酶链反应法,原
代培养
DETE