文档介绍：第二军医大学
博士学位论文
原发性胆汁性肝硬化比较蛋白质组学的基础与临床研究
姓名:赵鹏
申请学位级别:博士
专业:内科学(消化系病)
指导教师:朱樑
20090501
要摘【研究背景及目的】原发性胆汁性肝硬化琍且恢种饕R愿文谥行〉管的非化脓性进行性炎性损伤为特征的自身免疫性疾病。鸩∫洌够慢,最终可导致肝硬化等终末期肝病,其确切的发病机制至今尚不清楚。目前,恼锒现饕R谰萘俅采翱瓜吡L蹇固的检测,但是临床上仍有部分跣缘腜患者容易漏诊。熊去氧胆酸是其主要治疗药物,但是其对某些脑镀谥瘟菩Ч⒉焕硐搿因而如何早期诊断绾谓杏行У母稍ご硎荘研究的一个方向。由于人体诸多生命功能最终是通过蛋白质来完成的,在疾病的发生过程中,人体内蛋白质的种类和含量也会发生相应的改变,这就为我们对难芯刻峁┝艘个思路。而蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象,分析细胞内、外动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态,了解蛋白质分子之间的相互作用与联系。迄今国内外有关蛋白质组学技术研究南喙乇ǖ澜仙佟N颐谴拥鞍质组学的角度出发,利用同位素标记相对和绝对定量:弦合嗌质谱甅疢技术通过比较肝纤维化、斡不颊吆驼6哉杖群的血清蛋白质,筛选、鉴定颊哐G宀钜毂泶锏鞍祝⒔醒橹ぃ荚诙⒉』坪驼镏窝芯刻峁┠承├砺垡谰荨与此同时,疾病的动物模型也是研究疾病的一个重要方法。目前锬型大致分为三类:抗原免疫、化学物质诱导和基因缺陷。但是这些动物模型在肝脏病理变化和/或血清学生化以及自身抗体的表达等方面与人类苁谴嬖谝原发性胆汁性肝硬化比较蛋白质组学的基础与临床研究
——通过定差异。国外有文献报道部分肝炎患者在利用鲋瘟频墓讨谢峒谭,而我们在临床工作中也有类似发现,这给了我们一个建立锬P偷钠羰篊腹腔注射,诱导小鼠体内猘水平升高,进而建立模型。同时,利用蚅甅疢际醵圆煌锥蜳动物模型及其对照组血清及肝脏组织中的蛋白质进行比较,筛选、鉴定锬P脱G寮案巫橹差异表达蛋白,并进行验证,以期通过锬P偷难芯慷匀薖可能的发病机制和诊断有所启示。【实验方法】一、锬P徒周龄雌性小鼠只,体重约婊治狿对照组和篊模型组,端茄液稀释篊至痬DP妥楦鑀痥骨荒谧⑸次/周,对照组给予痥骨荒谧⑸次/周;每组分别与第堋周、周和周各处死只。⒀G逖分票秆矍蛘3⊙#。胄分钟,取血清,部分血清行生化及自身抗体检测,部分血清立即置于.。4姹赣谩断颈处死后,取肝脏于冰生理盐水中清洗,部分肝脏置入ジ6砹忠汗潭ǎ瘢蠬旧ê虲庖咦榛旧ǎ饩迪观察肝脏病理变化及肝内胆管变化;部分肝脏立即置于.℃保存备用。二、锬P脱G寮案卧嘧橹钜毂泶锏鞍咨秆⒓过柱去除高丰度蛋白;肝脏组织于屑羲橄慈パR海灰旱Q心セ旌希话凑樟⒏卧嘧橹分票⒀G寮案卧嘧橹分票附孔檠G甯髯曰旌希。胄分钟,第二军医大学博士学位论文篊
解液体积:组织重量::墓叵导尤肓呀庖尿素,硫脲,%,%,混悬,冰上裂解半小时。⒀返鞍字识客ü鼴ú舛ǜ髯檠分械淖艿鞍缀俊⒌鞍字实南捅昙羌尤牖乖约粒从小时;加入半胱氨酸封闭试剂,室温处理分钟;每管各加入预冷的丙酮#貉诽寤沉淀∈焙螅,离心分钟,取沉淀;加入溶解液煨充分溶解样品;按照酶:蛋白质:的比例加入胰蛋白酶,附夤梗型组,共埽鞴鼙昙鞘约林屑尤發乙醇,混匀,分别加入各管样品中,室温反应时,之后各加入三倍体积水,使标记试剂分解;合并各管标记好的样品,二维反相色谱一质谱联用狹,色谱分离分钟后行质谱鉴定,扫描>镄畔⒀Т恚秆〕三、人G宀钜毂泶锏鞍咨秆⒓ḿ把橹⒀G逖分票刚H巳憾哉铡、蜗宋虷肝硬化患者各例,清晨空腹取血,仓小时,后立即置于.。4姹赣茫唤孔檠G甯髯曰旌铣管,,,直鸨昙钦6哉铡周、周和周模真空冷冻干燥。⒉钜毂泶锏鞍字势追治觥⑸秆〖凹ú煌昙堑膇标记蛋白样品混合,经第一维强阳离子柱掷耄彩杖鎏荻冉械诙治觯弧5范围痾琈疢璺段/统计学上差异明显的蛋白质峰进行搜库、鉴定。胄分钟,取上清,分装胄分钟,过柱去除高丰度蛋白。⒀返鞍字识坎渭锬P脱返鞍字识俊原发性胆汁性肝硬化比较蛋白质组学的基础与临床研究
⒌鞍字实南捅昙遣渭锬P偷牡鞍字氏氨昙恰⒉钜毂泶锏鞍字势追治觥⑸秆〖凹ú渭锬P椭势追治龇椒ā⒗肳免疫印迹技术验证淋巴管内皮透明质酸受体托堑癊在颊哂胝H巳貉G逯械谋泶锊钜欤焕肊法验证视黄醇结合蛋白赑患者与正常人群血清中的表达差异。【实验结果】一、利用篊腹腔注射建立的锬P陀肴薖类似⒀G錋检测模型组血清剿媸奔涞难映ぶ鸾ド撸苁保模型组血清灾哂诙哉兆椤⒀G錋检测模型组自第苁技从行∈笱G逯谐鱿諥阳性,并随时间延长,其阳性率逐渐升高,至周模型组血清粜月蚀ィ照组血清一直未检测到模型组和对照组自第苁季行∈笱G蹇杉斐鯝阳性,但是其滴度不高;随着建模时间的延长,模型组从第苤恋芷溲G粜月示%,并且滴度均高于相应时间点的对照组,但是从第芸⒏巫橹±砑觳肝组织染色显示,光镜下对照组肝内胆管周围及汇浸润,随着建模时间的