文档介绍：基因工程药物研发的基本过程基因工程药物的研发分为上游和下游两个阶段: 上游阶段: 主要是分离目的基因、构建工程菌( 细胞)。目的基因获得后, 最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能,其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。下游阶段:从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化, 主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立, 新型生物反应器的研制, 高效分离介质及装置的开发, 分离纯化的优化控制, 高纯度产品的制备技术, 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造,电子计算机的优化控制等。血管抑制素(angiostatin , 简称 AGN) 是纤溶酶原的一个酶解片段, 相当于其 1~4 Kringle 区, 具有抑制内皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿瘤生长和转移的生物功能, 是一种新型血管生成抑制因子[1,2], 对于控制肿瘤、糖尿病视网膜病变、消化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研究价值和应用前景. PCR 产物的 T 载体克隆(一) 重组 T DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组,这样重新组合的 DNA 叫做重组体或重组子。重组的 DNA 分子是在 DNA 连接酶的作用下,有 Mg2+ 、 ATP 存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源 DNA 分子进行连接。 DNA 连接酶有两种: T4 噬菌体 DN A 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。两种 DNA 连接酶都有将两个带有相同粘性末端的 DNA 分子连在一起的功能,而且T4 噬菌体 DN A 连接酶还有一种大肠杆菌 DN A 连接酶没有的特性, 即能使两个平末端的双链 DNA 分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低, 一般可通过提高 T4 噬菌体 DNA 连接酶浓度或增加 DNA 浓度来提高平末端的连接效率。 T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分为 3步: 首先, T4 DNA 连接酶与辅因子 AT P 形成酶-ATP 复合物; 然后,酶-ATP 复合物再结合到具有 5’磷酸基和 3’羟基切口的 DNA 上, 使 DNA 腺苷化; 最后产生一个新的磷酸二酯键, 把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为 DNA 片断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是单酶切, 另一种是双酶切, 这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说, 载体与供体的末端都相同, 连接可以在任何末端之间进行, 这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底, 可对载体进行 5’除磷酸处理, 原理是连接酶只能连接 DNA 片断的 3’OH 末端与 5’端,所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时,由外源片断提供 5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说, 无论载体与供体同一片段上都有不同的末端, 这样就避免了载体与供体的自环, 能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。连接反应的温度在 37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即 12-16 ℃,连接 12-16h (过夜) ,这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。 Taq DNA 酶扩增的 PCR 产物,其 DN A 双链前后末端都有一个游离的 A 碱基, 可以与 pGEM-T Easy Vector 末端游离的 T 碱基互补形成环状重组 T 质粒。 1 材料外源 DNA 片断 2 仪器、用具移液枪、碎冰 3 试剂 pMD 18-T Vector ; Ligation buffer ; T4 ligatease ; rATP 4 方法连接体系如下: 16℃连接过夜。(二) 重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定 1 材料 JM109 菌株 2 仪器、用具超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器 3 试剂(1) CaCl2 、 LB 平板(见附录); SOC 培养基(见附录); SOB 培养基(2) RNase A1 ; Buffer S1; Buffer S2; Buffer S3; Buffer W1 ;无水乙醇的 Buffer W2a (3) 1× 电泳缓冲液( TAE ) ;溴化乙锭溶液( EB )[ 有毒,小心] ;琼脂糖; 6× 加样缓冲液(4) 酚;氯仿;异戊醇(5) ddH2O ; 10× PCR Buffer (Mg2+ plus) ; dNTP ; M13+ ; M