文档介绍：基因工程药物研发过程
目的基因的获得:
将生产干扰素的白细胞的mRNA分级分离,然后将不同部分的mRNA注入蟾蜍的卵母细胞,并测定合成干扰素的抗病毒活性,结果发现12SmRNA的活性最高,因此用这部分mRNA合成cDNA。
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中,转化大肠杆菌K12,的几千个重组子克隆,每个克隆都用粗提的干扰素的mRNA去进行杂交。
把得到的杂交阳性克隆中的重组质粒DNA放到一个无细胞蛋白合成体系中进行翻译,对每一个翻译体系的产物进行抗病毒的干扰素活性检测,经过多轮筛选获得了产生干扰素的cDNA。最后将干扰素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体中,转化大肠杆菌进行高效表达。产物的提取和纯化
? 把发酵产物4000r/min离心30min,弃上清得1000g左右
? 取100g湿菌体重新悬浮于500ml,20mmol/L磷酸缓冲液中(),冰浴,超声波破
碎,离心取沉淀。
? 尿素、磷酸缓冲液、二巯基苏糖醇室温搅拌抽提2小时。
? 离心取上清,磷酸缓冲液(),加二巯基苏糖醇至
,4℃搅拌,15小时,离心除去不溶物。
? 上清液经中空纤维超滤器浓缩
? 将浓缩的人干扰素α2b溶液经过Sephadex D50 分离,收集人干扰素α2b部分,经
SDS-PAGE检查。
? 将Sephadex D50柱分离的人干扰素α2b组分,再经DE-52柱(2厘米*50厘米)纯
化人干扰素α2b组分,,收集含人干扰素α2b的洗脱液。
? 全过程蛋白回收率为20-25%,产品不含杂蛋白,DNA及热源含量合格。
、半成品检定
(1)效价测定
用细胞病变抑制法,以Wish细胞、VSV病毒为基本检测系统,测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。
(2)蛋白质含量测定
福林-酚法,以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。
(3)比活性
效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。
(4)纯度
电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法,银染显色应为单一区带,经扫描仪测定纯度应在95%以上。
( 5)相对分子量测定
还原型SDS-PAGE,加样量不地域微克,同时用已知相对分子量的蛋白
标准系列做对照,以迁移率为横坐标,相对分子量的对数为纵坐标作图,计算相对分子量。与理论值比较,误差不得高于10%。
(6)残余外源性DNA含量测定
用放射性核素或生物素探针法测定,每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。
(7)残余血清IgG含量测定
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检