文档介绍：基因工程药品研发基础过程
基因工程药品研发分为上游和下游两个阶段:
上游阶段: 关键是分离目标基因、 构建工程菌(细胞)。 目标基因取得后, 最关键就是目标基因表示。 选择基因表示系统关键考虑是确保表示蛋白质功效, 其次是表示量和分离纯化难易。 此阶段工作关键在试验室内完成。
下游阶段: 从工程菌大量培养一直到产品分离纯化和质量控制。 此阶段是将试验室结果产业化、 商品化, 关键包含工程菌大规模发酵最好参数确实立, 新型生物反应器研制, 高效分离介质及装置开发, 分离纯化优化控制, 高纯度产品制备技术, 生物传感器等一系列仪器仪表设计和制造, 电子计算机优化控制等。
血管抑制素(angiostatin ,简称AGN) 是纤溶酶原
一个酶解片段,相当于其1～4 Kringle 区,含有抑
制内皮细胞增殖、 抑制血管生成及抑制多个类型肿
瘤生长和转移生物功效,是一个新型血管生成抑
制因子[1 , 2 ] ,对于控制肿瘤、 糖尿病视网膜病变、 消
化道溃疡、 关节炎等病理性血管生成含相关键研
究价值和应用前景.
PCR产物T载体克隆
（一）        重组T质粒构建
一．原理
外源DNA和载体分子连接就是DNA重组, 这么重新组合DNA叫做重组体或重组子。 重组DNA分子是在DNA连接酶作用下, 有Mg2+、 ATP存在连接缓冲系统中, 将分别经酶切载体分子和外源DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种: T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。 两种DNA连接酶全部有将两个带有相同粘性末端DNA分子连在一起功效, 而且T4噬菌体DNA连接酶还有一个大肠杆菌DNA连接酶没有特征, 即能使两个平末端双链DNA分子连接起来。 但这种连接效率比粘性末端连接率低, 通常可经过提升T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提升平末端连接效率。 T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步: 首先, T4 DNA 连接酶和辅因子ATP形成酶-ATP复合物; 然后, 酶-ATP复合物再结合到含有
5’磷酸基和3’羟基切口DNA上, 使DNA腺苷化; 最终产生一个新磷酸二酯键, 把切口封起来。 连接反应通常将两个不一样大小片断相连。 因为DNA片断有两个端点, 所以切割时出现两种可能, 一个是单酶切, 另一个是双酶切, 这两种酶切方法在基因工程操作中全部常常见到。 对于单酶切来说, 载体和供体末端全部相同, 连接能够在任何末端之间进行, 这么就造成了大量自连接产物。 为了降低自环高本底, 可对载体进行5’除磷酸处理, 原理是连接酶只能连接DNA片断3’OH末端和5’端, 所以除磷后载体不会自环。 一旦有外源片断插入时, 由外源片断提供5’端就能和载体进行连接。 经过这种方法可大大降低由载体自
环造成高本底。 对于双酶切来说, 不管载体和供体同一片段上全部有不一样末端, 这么就避免了载体和供体自环, 能使有效连接产物大大增加。 双酶切另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应温度在37℃时有利于连接酶活性。 不过在这个温度下粘末端氢键结合是不稳定。 所以采取折中温度, 即12-16℃, 连接12-16h（过夜）, 这么既可最大程度地发挥连接酶活性, 又兼顾到短暂配对结构稳定。 Taq DNA酶扩增PCR产物, 其DNA双链前后末端全部有一个游离A碱基, 能够和pGEM-T Easy Vector 末端游离T碱基互补形成环状重组T质粒。
二．材料和方法
1 材料
外源DNA片断
2 仪器、 用具
移液枪、 碎冰
3 试剂
pMD 18-T Vector; Ligation buffer; T4 ligatease; rATP
4 方法
连接体系以下:
16℃连接过夜。
（二）        重组质粒转化及阳性克隆判定
1 材料
JM109菌株
2 仪器、 用具
超净工作台、 离心机、 恒温摇床、 恒温培养箱、 培养皿、 试管、 离心管、 电泳仪、 电泳槽、 凝胶样品梳、 移液器
3 试剂
(1) CaCl2、 LB平板（见附录）; SOC培养基（见附录）; SOB培养基
(2) RNase A1; Buffer S1; Buffer S2; Buffer S3; Buffer W1; 无水乙醇Buffer W2a
(3) 1×电泳缓冲液（TAE）; 溴化乙锭溶液（EB）[有毒, 小心]; 琼脂糖; 6×加样缓冲液
(4) 酚; 氯仿; 异戊醇
(5) ddH2O; 10×PCR Buffer (Mg2+ plus); dNTP; M13+; M13-; TaK