文档介绍：西南农业大学
博士学位论文
外源基因在家蚕中靶向整合及线粒体载体研究
姓名:汪琳
申请学位级别:博士
专业:特种经济动物饲养
指导教师:周泽扬;夏庆友
踢二
摘要
〔家蚕是蛋白质高效转化生物,具有周期短、繁殖率高、后代个体数多、“旨少、量“养
等优点。蚕丝业在我国已有五千多年历史,家蚕作为一种模式生物,其基咄研万拼分子
生物学研究取得了巨大进展,开展其转基因研究白勺基石出条件正日趋成熟夕家蚕转基因研
究在基础理论研究、特异品种培育和生物工程制药上,都具有巨大的潜力和实际愈义。
基础理论研究方面,由于外源基因在宿主中能进行复制整合与表达,并受制于受体因
组遗传背景的调控,因此转基因本身成为一个理想的功能标记,在基因表达调拄机理研
究方面颇有价值,如近来时空特异性顺式调控元件及其远程作用力、反式作用】子及其
相互作用、基因协同表达、复合型启动子增强子外源基因的反馈调节以及染色‘内重组
等一系列重要发现就得益于转基因模型在品种改良方面,可改良家蚕的某些性状,如
抗病性、性别控制、改进蚕丝的品质和加工性状等在生物反应器开发方而,、立可利用
转基因家蚕生产工程蛋白及高附加值产品,如人抗血友病因子、白细胞介素等水
但遗憾的是家蚕不能象哺乳动物那样,可通过受精卵显微注射一细胞培养一受精卵
移植一发育成成熟个体的途径制作转基因个体,而只能通过将外源基因导入蚕的方式
来实现。但蚕卵卵壳坚硬,卵黄丰富,外源基因难以穿透坚硬的卵壳进入细胞核斤且
目前合载体不够理想,外源基因即使转移到家蚕受精卵中,也很难稳定整介到家蚕
基因组中,这两点限制了家蚕转基因研究的发展。
本论文针对这两个问题,以精子介导法利用同源重组技术对家蚕丝素重链进行
基因打靶,探讨了精子介导法导入外源基因的优越性、外源基因在宿主细胞中的滞留与
整“、同”重组发生的动态““,以及用”粒”作家蚕”基因载”的可行等·仲
将主要研究内容和结果总结如下
引导同谭重组的同源借池的构建
为了探索一条更为有效的整合策略,使外源基因能定点整合到靶位点又破坏宿
主基因的启动子、内含子等表达调控元件,令外源基因对宿主生理功能的影响达到最小,
我们以丝素重链基因号外显子为整合靶位点,以便将外源基因定点整合其间为此,
需要在其两端接上与丝素基因同源的片段,以引导同源重组的发生。分析份素链
基因号外显子结构,发现其山个结晶区与个不定型区祖间排列而成,、是扩增
其结晶区作同源臂。但由于结晶区含量高,序列内部重复性高,二级结构复决,常规
无法扩增出目的产物。本研究通过调整反应体系缓冲液值、采用高保真
聚合酶和酶组合、加缓解二级结构的有机试剂甲胺、换引物多步扩增而成功实现
了重复区片段的扩增。将扩增产物克隆进质粒载体中,就构建成同源臂
两盛
池。这为高含量、高重复性模板、较长靶序列复杂扩增提供了可借鉴之路。
将缓冲液的提高到,以补偿因温度增高带来的下降,
而避免脱嚓吟事件的发生,刁’能保证长序列的顺利进行。
高含量使模板二级结构复杂而稳定,一般热启动难于解开,而变性温度过高、时
间过长又不利于聚合酶的活性作用发挥,于是借助能缓释模板二级结构的有机试剂
甲胶扩增高含量模板。
聚合酶比酶有更高的保真复制性能和热稳定性,更有利于高含量模
板的扩增。热循环完成后,加入具有’’核酸外切酶活性的片段温育,
能切除误配碱基,而降低多步扩增中碱基误配级联扩增的错误。
精子介导法向家蚕导入外源基因
先将外源目的基因克隆到质粒的多克隆位点,再将克隆的结晶区挤列
和分别引入到的两端,得到以绿色荧光蛋白为报告基因的同源打靶质粒
将打靶质粒酶切线性化后,分别注入到雌蛾交配囊和雄蛾贮精囊,与正常蛾交配产卵,
分析外源基因在当代的情况。实验结果,精子介导法制作转基因蚕的阳性率约为
说明亥方法是可行的。但分析结果同时表明,外源在受精卵中是不均匀分的,同
一蛾区也存在嵌合现象,有些个体是转基因蚕,有些则不是,这就增加了转基囚蚕筛选
和继代的难度。将外源注射进雄蛾贮精囊比注射到雌蛾交配囊后代有更币的阳性
率,且同蛾区嵌合现象轻些。
外源荃因在宿主细胞中的滞留与整合
为了探索转基因的分子生物学特性,本研究探讨了外源基因在宿主细胞中的滞留和
整合情况,发现外源基因随精子进入家蚕受精卵后,在整合前有一个滞留期,该时期
发生一系列染色体外重组、修饰事件注入的外源分子末端发生蚕食,随,,了一部分
分发生分子间连接产生线状多联体,其游离端是重组的优选位置一部分分广产生分
子内连接,头尾相连成环状。环状多联体在不断参与连接过程中再开裂成