文档介绍：及其功能研究人纤溶酶原重组腺病毒的构建本课题获:资助专业:生物化学与分子生物学硕士研究生:刘杏师:高国全教授导年鹿阒国家自然科学基金教育部新世纪人才基金广东省科技计划项目重大专项广东省自然科学基金团队项目广州市科技攻关重点项目
摘要人纤溶酶原重组腺病毒的构建及其功能研究硕士研究生:刘杏指导老师:高国全教授血管增生与肿瘤的生长与转移、血管增生性眼病、类风湿的两个方面:要么应用血管增生抑制剂,要么采用血管增生刺激因子的拮抗剂,以恢复病理状态下被打破的血管增生调空的平衡。近年来,人纤溶酶原乃馄蝛蚱涠捞氐男灾室鹆丝蒲Ы绲闹厥印是人纤溶酶原中第五个环状结构域,能特异性的抑制内皮细胞生长,是最强的血管增生抑制因子之一。本实验室在以前的研究中,利用原核表达体系获得和突变体重组蛋白,并观察它们对糖尿病性视网膜病和肿瘤的作用。研究显示具有分子量小,性质稳定,能有效的抑制血管内皮细胞的迁移以及增殖,对于糖尿病性视网膜血管增生和肿瘤的生长具有较强的抑制作用。注射等无法克服的缺点,且不利于用于进行内源性的作用机制的探讨。因此,陷性腺病毒载体具有安全、高效、简单易行等优点,我们选择了系统来作为基因治疗的载体。是缺陷性腺病毒的骨架质粒,通过其穿梭的重组腺病毒。本研究构建携带基因筒缓婧诵藕烹的重组腺病毒,鉴定腺病毒感染力和目的基因表达情况,并进行基本的细胞内功能研究,为进一步研究携带的腺病毒体内抑制血管增生的效果和机制奠定基础。关节炎等重大疾病密切相关。目前治疗血管增生性疾病着眼于血管增生平衡调空由于原核表达基因工程重组蛋白具有毒性无法去除,在体内易降解,需反复本研究在原有的工作基础上,希望通过基因治疗的途径来改善上述问题。鉴于缺质粒庠葱曰蛴氩《竟羌苷稀4佣俺鼍哂泄惴焊腥拘
第一部分病毒骨架的构建第二部分重组腺病毒的包装纯化与功能实验方法:根据的序列设计特异性引物,将其重组进入质粒用以获取质粒中的真核信号肽序列;根据的序列设计特异性引物,分别克隆出不带信号肽的与携带信号肽的基因片段婧诵藕烹男蛄欣丛从趐柿,将其重组进入腺病毒穿梭质粒构建重组体;将穿梭质粒与一柿线性化后在大肠杆菌中同瓺序列分析显示穿梭质粒构建正确;脂质体包裹法将上述三种纯化灭菌的病毒骨架既赴结果:测序鉴定重组质粒;源重组;将上述同源重组质粒甀线性化后获得三种病毒骨架.、.ú《竟羌堋盖屑ㄖっ魍粗刈槌晒Γ琍鉴定证明病毒骨架中携带有目的基因。中,包装病毒;观察谋泶锴榭觯兆笥叶橙诜呀庀赴袢≡《疽海用原代病毒液感染赴罅坷┰霾《荆梯度离心纯化病毒液:感染细胞、肝细胞,内皮细胞等观察病毒感染能力;检测病毒携带的基因表达情况;摘要Ⅱ
,我们初步认为可以通过迸入到细胞内发挥关键词:结果:ḿ觳庵刈椴《径匀似昃猜瞿谄は赴鲋车挠跋臁绿色荧光蛋白泶锵允静《景傲己茫纯化后病毒具有很高的感染细胞的能力;産峁允眷勾鳮虻南俨《究稍谒拗飨赴斜泶颣和蛋白。峁允竞氩缓藕烹牡腒刈橄俨《揪幸种蒲9茉錾的作用。晒菇薃狵以及三个重组腺病毒骨架质粒;毛成功包装出了、以及鲋刈橄俨《荆炕蟮娜植《径匀苏8蜗赴赴⑷似昃猜瞿谄は赴榷种细胞中都具有很高的感染力;重组腺病毒在细胞中成功表达出目的蛋自,显示重组腺病毒具有表达目的蛋白的活性;甅结果显示含与不含真核信号肽的重组腺病毒均对血管内皮细胞有作用。对于是否存在其他作用模式,或者在胞内发挥作用的具体位置和作用方法,。纤溶酶原;恢刈橄俨《荆换蛑瘟疲摘要
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,基因治疗所用的载体可分为非病毒、病毒载体两大类。载体携带目的基因的靶向高效表达是基因治疗成功的关键。其中,腺病毒载体有易于包装和扩增,感染宿主范围广,对人致病性低,能感染增殖与非增殖期细胞,病毒滴度高等特点,且该病毒不整合到染色体中,无插入致突变性,因此腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域“H讼巳苊冈灿龌纷唇峁褂,各环状结构域氨基酸序列同源性为%~%,且许多水解片段均具有抑制内皮增生的活性,并能抑制多种实验性肿瘤生长、转移。是人纤溶酶原中第五个环状结构域,能特异性的抑制内皮细胞生长,是最强的血管增生抑制因子之一。本研究将利用一刈橄俨《鞠低彻菇ê琄基因的重组腺病毒,从基因治疗的途径研究治疗血管增生和肿瘤生长的功能与机制。年疪却有伟┑妥R仆槐渲∈蟮哪蛞汉脱G逯分离纯化得到血管抑素肴讼巳苊冈一δ芮懈叨韧葱浴H讼巳苊冈欠肿恿课个丝氨酸蛋白酶结构域和鐾ü蚣拥幕纷唇峁褂琄钩扛龌纷唇峁褂蛴霭被嶙槌桑个二硫键,