文档介绍：山西医科大学
硕士学位论文
RNA干扰抑制Sp1对大肠癌SW480细胞端粒酶活性的影响
姓名:赵利国
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:程牛亮
2011-05-20
山西医科大学硕位学位论文
RNA 干扰抑制 Sp1 对大肠癌 SW480 细胞端粒酶活性的影响
中文摘要
研究背景:
大肠癌是西方国家最主要的恶性肿瘤之一,在我国近年来大肠癌发病率和死亡率不断
上升的趋势也引起了广泛的关注。开展对大肠癌的分子生物学研究不仅对理解癌的本质有
理论意义,而且对指导大肠癌的防治有实用价值。由于大肠癌的解剖组织学特点和肿瘤的
生物学特性。大肠癌的独特之处在于其从正常粘膜到增生,从良性腺癌到恶变,从原位癌
到浸润转移, 各个阶段区分明确; 从同一个体上往往可以同时获得从正常粘膜到转移癌
发展不同阶段的组织标本用于比较研究,同时大肠癌可以明确区分为易感倾向遗传的遗传
型及易感倾向不遗传的散发性,这就为研究大肠癌的细胞遗传学和分子遗传学提供了最好
的材料。从分子生物学角度看大肠癌是目前研究最广泛,了解最透彻,性质最清楚的肿瘤,
可以作为肿瘤发生过程中基因表达和结构改变的一个模式。
肿瘤的发生和发展是目前肿瘤的研究热点,而端粒酶的激活与癌症高度相关,提示端
粒酶、端粒和端粒维持间的互相影响是癌症衍变过程中至关重要的一步。研究表明端粒
酶的活性在正常人体细胞中不表达或低表达,它存在于人的生殖细胞、肿瘤细胞、永生
化细胞系和再生组织(例如,血液、皮肤和小肠上皮)中。人端粒酶复合体由3个主要的亚
单位组成:端粒酶 RNA组分( hTR) ,端粒酶相关蛋白( TP1 /TEP1 )和端粒酶催化亚单
位( hTERT)。 Sp1是结合到 hTERT核心启动子GC富含位点和激活 hTERT转录的关键分
子。因此,应用 RNA干扰(RNAi)技术抑制SW480细胞Spl基因的表达,进而抑制端粒酶活性,
来影响肿瘤细胞的生长, 将有助于进一步明确 Sp1基因在大肠癌发生、发展中的作用及其
可能机制,为大肠癌的预防和治疗提供切入点,在大肠癌的基因治疗方面有较大的应用前
景。
目的:
Sp1 基因的 RNA 干扰真核表达载体(pGenesil-1-Sp1,简写 p-shRNA);
pGenesil-1-Sp1 对大肠癌 SW480 细胞中 Sp1 基因的表达的抑制作用;
Sp1 沉默对大肠癌 SW480 细胞内 hTERT 及端粒酶活性的抑制作用
方法:
1. 合成针对 Sp1 基因的短发夹结构真核表达载体 pGenesil-1-Sp1 与其对照载体 pGenesil-1-
CON(简写 p-CON)经双酶切琼脂糖凝胶电泳及 DNA 测序鉴定;
2. 利用脂质体介导将真核表达质粒 p-shRNA 和 p-CON 转染人大肠癌细胞株 SW480,提
取总蛋白质,应用 Westernblot 技术检测其对 Sp1 蛋白质表达水平的影响。
山西医科大学硕位学位论文
3. 利用 RT-PCR 检测转染后大肠癌细胞 SW480 的 hTERT 基因表达水平的变化情况
4. 利用 TRAP-银染法检测转染后大肠癌细胞 SW480 的端粒酶活性变化情况
5. MTT 检测转染后大肠癌细胞 SW480 细胞活力
6 . 流式细胞术检测转染后大肠癌细胞 SW480 细胞的凋亡情况
结果:
1. 酶鉴定和 DNA 测序证明成功构建了针对 Sp1 基因的 RNA 干扰真核表达载体;
2. 经MTT结果显示,SW480细胞转染重组质粒后,实验组A490值显著低于相同时间点对照组
和正常组细胞,在24h、48h、72h、%、%、%、%;
表明抑制Sp1表达可能通过抑制hTERT的表达有效抑制SW480细胞的体外增殖能力。
3. 经流式细胞术检测发现,沉默 Sp1 后 72 h 后,沉默 Sp1 后 72 h 后,SW480 细胞出现
明显凋亡,% ±%,而阴性对照组细胞的凋亡率为 %±%。说明S p1
基因沉默可能通过抑制 hTERT 的表达促进大肠癌细胞凋亡增加。
4. 转染 SW480 细胞后,各组中 Sp1 蛋白表达的灰度值为 SW480/p-shRNA(±),
SW480/p-CON(±),SW480(±)。转染 pGenesil-1-Sp1 后,可以抑制 SW480
细胞中 Sp1 蛋白的表达
5. Sp1 沉默后在 SW480 细胞中的 hTERT