文档介绍：中山大学
硕士学位论文
华支睾吸虫GST2-
研究
姓名:李彩霞
申请学位级别:硕士
专业:临床检验诊断学
指导教师:余新炳
20090605
华支睾吸虫基因克隆表达及免疫学功能初步研究中文摘要专业:临床检验诊断学硕士研究生:李彩霞师:余新炳教授导华支睾吸虫殖聘挝,其寄生在人体肝胆管内所引起的以肝胆病变为主的疾病称为华支睾吸虫病殖聘吸虫病。华支睾吸虫病广泛分布东南亚地区,我国是最主要的流行区。全球华支睾吸虫感染人数大约万,我国感染人数约万,其中广东省约颉A酱稳ü寄生虫病的调查结果显示华支睾吸虫感染率呈明显上升趋势。华支睾吸虫病是目前我国流行最严重的食源性寄生虫病。年,华支睾吸虫病被广东省政府列为重点防治的地方病。年,华支睾吸虫病被卫生部列为我国重点防治的寄生虫病之一。华支睾吸虫病的正确诊断是防治的关键。目前华支睾吸虫病的诊断主要依靠病原学检查和免疫学检查。传统的病原学方法是镜检粪便中的虫卵,由于华支睾吸虫排卵具有周期性且虫卵很小,容易漏诊,且操作费时费力,不适合流行病学调查。免疫学诊断方法具有高度的敏感性和特异性,其中酶联免疫吸附试验僮简便,血样用量少,适合现场应用,是目前流行病调查中应用最为广泛的免疫诊断方法。目前用于华支睾吸虫病免疫诊断的抗原主要是成虫粗抗原,但粗抗原制备困难,及检出的特异性和敏感性不是很理想,因此,应用基因工程技术合成重组抗原替代中山大学硕士学位论文华支睾吸虫..蚩寺”泶锛捌涿庖哐Чδ艹醪窖芯本课题由:挝娌∑詹槭约梁屑叭氛锸约梁械难兄乒阒菔锌萍技苹钅鹱手阒莨茉蚕叱婧突Vω何娌」丶乐渭际醯难芯”专题基金资助
研究目的研究方法甌基因的生物信息学分析菇ɑVж何鍳蚑融合蛋白供的生物信息学工具分析预测的理化特点、二级结构、拓扑结构及亚细胞粗抗原是免疫诊断试剂盒研制的必然趋势,关于华支睾吸虫免疫诊断抗原的筛选和评价是国内外华支睾吸虫病研究的重点。华支睾吸虫表膜脱落分子可以进入血液循环,刺激宿主产生抗体,而且与宿主肝胆管直接接触的虫体表膜抗原可以引起局部粘膜反应,因此表膜抗原在华支睾吸虫免疫、致病中有重要作用。本实验室前期通过间接椒ㄆ兰种华支睾吸虫重组蛋白的免疫诊断价值,发现华支睾吸虫成虫谷胱甘肽转移酶奶匾煨员冉细撸舾行匀圆簧趵硐搿K孀呕蚬こ技术的进展,可以根据需要对基因进行连接以提高重组抗原的诊断敏感性。为此,我们利用生物信息学技术,对本室构建的华支睾吸虫成虫文库进行筛选,从中挑选具有诊断价值的表膜蛋白基因,将其与构建融合蛋白,并对融合蛋白的诊断价值进行初步验证,期望为华支睾吸虫病的诊断做出积极有益的探索。识别、克隆华支睾吸虫成虫谷胱甘肽转移酶氨砟さ鞍.,≈罸靥迳希菇ㄈ诤系鞍住Mü浣覧方法评价该融合蛋白检测华支睾吸虫病流行区的正常血清、感染血清中的亚类的敏感性和特异性,为华支睾吸虫免疫诊断抗原的筛选探索新的途径。华支睾吸虫成虫质粒文库进行表达序列标签随机测序和椴ⅰ⑵。利用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统站点提定位等。中山大学硕士学位论文华支睾吸虫..蚩寺”泶锛捌涿庖哐Чδ艹醪窖芯
、,利用聚合酶链反应踊Vж何娉沙鎒目庵柿V欣┰龀鯣腃。定向克隆该序列到质粒校灾刈橹柿=蠵、双酶切和测序鉴定。.虻睦┰觥⒖寺。,利用聚合酶链反应踊Vж何娉沙鎒目庵柿V欣┰觥6ㄏ蚩寺「眯蛄到质粒中,对重组质粒进行⑺盖泻筒庑蚣ā融合蛋白的表达和纯化将构建的重组质粒转化大肠杆菌/校贗盏枷卤泶锶诤系鞍祝并经甈ǎ刈榈鞍装寰蛩乇湫院笥们缀筒阄龃炕随机选取份轻、中、重度感染的华支睾吸虫病人血清,份健康人血清,份不同感染度的日本血吸虫病人血清,间接ḿ觳馊诤系鞍椎恼锒霞壑担⒈较融合蛋白与诊断的敏感性、特异性。甌基因的生物信息学分析从猩秆〕隼吹膃蛄惺荂的8眯蛄锌7旁亩量虺理论分子量为.,%。.、双酶切和测序鉴定后证实构建成功。,对重组质粒进行⑺盖泻筒庑蚣ê螅中山大学硕士学位论文华支聿吸虫..蚩寺”泶锛捌涿庖哐Чδ艹醪窖芯
研究结论实构建成功。重组质粒在诱导下表达重组蛋白,经狿允居肜砺墼げ獾融合蛋白分子量相符,表达产物经尿素变性、亲和层析纯化,获得目的蛋白。浣覧法评价该融合蛋白与检测亚类的敏感性和特异性应用椒ǎ直鹨灾刈槿诤系鞍缀虶<觳饪乖臁穞莶煌腥度华