文档介绍：免疫组化和荧光
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免疫组化图片
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免疫荧光图片
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免疫组化与免疫荧光
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素等) 显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法；这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们****惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。
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实验原理
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 显色来确定组织细胞内抗原；免疫荧光技术是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
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实验步骤
脱蜡水化：
二甲苯Ⅰ 20min
二甲苯Ⅱ 20min
无水乙醇Ⅰ 10min
无水乙醇Ⅱ 10min
95%乙醇 5min
80%乙醇 5min
75%乙醇 5min
50%乙醇 过一遍
蒸馏水 过三遍
高压修复 4min
流水冷却
PBS冲洗 5min×3次
3%H2O2 15 min，37 ℃/(%Triton 5min)
PBS冲洗 5min×3次
10%山羊血清封闭 37℃，50min
一抗 4 ℃ ,过夜
复温 37 ℃ ，1h PBS 冲洗 5 min x3 次 二抗 30 min PBS 冲洗 5 min x3 次 DAB显色 ＜1min /(DAPI 5min) PBS冲洗 (盖片，观察。)
苏木素复染 1min
自来水冲洗
脱水，透明，封片。
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抗原修复——原因 *常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得： -抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇； -蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 *要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
方法：微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等， mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
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注意事项
标本固定
脱水、石蜡包埋和制片
脱蜡和水化
抗原修复
细胞通透
灭活内源性过氧化物酶和生物素
血清封闭
一抗和二抗浓度和孵育时间
抗体稀释液
切片清洗
DAB显色
避光
复染
封片
①防止标本从玻片上脱落；
②除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；
③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛
脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。
为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。
使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；过氧化氢孵育时间过长易引起脱片
组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；但不能与一抗来源一致。一般室温10-30min。