文档介绍：野外水样的 DNA 提取方法 1、用于检测 mcy E 基因表达的芯片与定量 PC R 的研究《 Development ofa Chip Assay and Quantitative PCR for Detecting Microcystin Synthetase E Gene Expression 》 MATERIALS AND METHODS : 从无菌的产肝*** Anabaena and Microcystis aeruginosa PCC 7806 提取 DNA 和 RNA 。藻种在 Z8 培养基中培养 21 天, 25°C, 5-6 μ mol m -2s -1 不连续光照,采用 5μm孔径的聚碳树脂滤器收集细胞。此外, 为使 qPCR 最优化,从 15株 Microcystis,13 株 Anabaena, 2株 Planktothrix, 2株 Nostoc, 及2株 Nodularia 提取 DNA 备用。 2006 年6 月至 9 月从 Tuusulanja ¨ rvi 湖采集 5 个水样。用带槽样板从 0-2 米深处采集 100-250ml 复合水样, 并用 5μm及1μm 孔径的聚碳树脂过滤收集。对样品的 DNA 、 RN A 及微囊藻***进行收集。用于 RNA 提取的水样在湖滨取样后立即过滤, 原位冻存在液氮中。而用于 DNA 及微囊藻***提取的水样运输到实验室后再过滤。在提取前,用于 DNA 和微囊藻***提取的样品冻存在-20 °C, 用于 RNA 提取的样品冻存在-70 °C。核酸提取及反转录: 采用 bead beating and the cetyltri methylammonium bromide (CTAB) 法提取藻种及野外水样中的 DNA ( Kolmonen18 ) 。根据 Gene Clean Turbo kit 指南进行进一步纯化(Q-Biogene) 。通过紫外分光光度计(Biophotometer;Eppendorf) 测量提取的 DNA 含量及质量。 RNA 提取时, 过滤器转换到 FastPrep Lysing matrix Etubes (Q-Biogene) , 细胞裂解于 1 ml PMR1 溶液(MO BIO Laboratories Inc.) 中,用 FastPrep FP120 bead beater(Thermo Electron Corporation) 于 5m s -1, 搅拌 40s 。随后,用 Ultraclean Plant RNA kit Mo Bio Laboratories) 分离 RNA 。对于环境中的 RNA 样品, 将两个过滤器联合使用以增加总的 RNA 量。提取的 RN A 用 DNase I 按说明书( Promega )处理两遍。处理后的 RNA 用苯酚- ***仿萃取,以使酶失活及去除, 乙醇沉淀, 用水稀释至终体积为 50μl。采用 NanoDrop-1000 分光光度计测(Nanodrop Technologies) 量 RNA 的含量及质量。通过 mcy E qPCR 证实 RNA 样品中不含 DNA 。用5至 15μl的 RNA 作为模版, iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad) 为试剂盒将 RN