文档介绍：RAPD分析中大豆基因组 DNA的快速制备
 温和的条件下操作, 如尽量减少酚/***仿抽提的次数、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的 DNA。另外
在吸取上清的步骤中, 所用枪头最好用剪刀把枪头尖儿稍剪一点, 并在酒精灯上烘烤一下, 这样做可
以防止因枪头尖过细而对大分子量 DNA所产生的机械剪切作用。
从本实验的步骤和结果可以看出, 用此方法小量提取的基因组 DNA用时较少(一般在 3 h 内均可
完成), 保证质量, 得率较高, 并且实验所用药品和仪器均为分子生物学实验常规配备, 所得 DNA 可直
接用于基因组文库构建、 Southern 杂交、 RFLP 和 RAPD等实验漂洗 1 次, 真空干燥或晾干, 溶于 200μl TE 或 ddH2O, - 20℃保存备用。
2 结果与分析
DNA浓度及提取率的测定
取2μL DNA溶液, 加1μL上样缓冲液, % 琼
脂糖凝胶上100 V电压电泳1 h,用2μL λDNA(50
ng/μL) 和1kbDNA Ladder作Marker,凝胶用溴化乙锭
(EB)染色, 紫外灯下观察电泳结果(图1)。在加样孔附
近呈现一致密亮带, 分子量较高(>20 kb), 且无降解现
象, 与λDNA亮度作比较, 可判断所提DNA浓度大约
为200 ng/μL, DNA得率(μg/g材料鲜重)=DNA浓度/取
材量(g), 约为80μg/g。
DNA纯度和质量的检测
采用紫外分光光度法, 可以检测DNA的纯度。纯净
的DNA溶液其OD260/。如果OD260/
, 表明含有较多的RNA; 如果OD260/
, 则说明样品中蛋白质较多;通常260/
佳质量要求, 。
将所提取的 DNA 稀释后(稀释倍数为 25), 以稀
释所用超纯水为对照,用分光光度计测定其在 260
nm、 280 nm 波长处的光吸收值:OD260/OD280=
(为 5 次提取结果的平均值)。表明所得的 mtDNA 纯
度较高, 无 RNA和蛋白质的污染。
PCR 扩增结果
随机选取5个RAPD随机引物(OPERON公司)进行
PCR扩增反应, 反应体系为25μL, 其中包括10× Buffer
(含Mg2+
), 10mmol/L dNTPs , Taq酶1U, 引
物2μL, 模板DNA20ng, 其余体积用超纯水补齐。PCR
反应在T- G96型DNA扩增仪中进行,反应程序为94
℃
预变性5 min、 94 ℃变性1 min, 36 ℃退火1 min, 72 ℃延
伸1 min 30 s, 40个循环; 再72
℃保温10min。扩增产物
% 琼脂糖凝胶上120V电压电泳1 h~ 2 h,紫外灯
下观察照相(图2), 所选引物均能良好扩增, 扩增条带
清晰, 效果良好。
3 讨论
因大豆材料中含有较多的蛋白和脂类, 一般提取
方法多采取增加抽提次数来获得较纯净的 DNA, 但
对 DNA产率有重大影响, 选择在提取缓冲液中加入一定量