文档介绍：上海中医药大学
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案(1)
课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数 48
专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤、管冬元、潘志强
内容
绪论、重组质粒
时数
5
本次课目的要求
了解分子生物学常用技术的沿革、任务和在中医药学中的地位和作用。
了解分子生物学的常用载体质粒及其特征。
掌握重组质粒方法。
本次课的重点难点
重点放在中医药研究中的应用,解决为何用、如何用。要求深入浅出地介绍,例举中医药研究事例说明。
分子生物学的常用载体质粒及其特征。
方法:理论部分一道进行,然后实验。
本次课的应用教具
多媒体设备。
重组质粒实验及有关仪器设备。
实验25 重组质粒
实验目的
,用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。方法是:把某一DNA片段插入到相应的载体(比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等),给予扩增,用以标记探针、测序、cDNA库建立、基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒就成为中医药实验研究中最为常规的实验。
通常,扩增目的DNA主要借助两类方法,即PCR技术和载体重组技术,鉴于PCR技术受到酶的性能和方法学等多方面的限制,某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难,所以载体重组技术倍受青睐。
。
PCR产物的克隆和测序。
、cDNA库,等。
常用的载体主要有质粒、λ噬菌体、粘粒载体等,哺乳类细胞表达载体是一种经改造的质粒,其中使用最广泛的是质粒。
质粒是一类双链、闭环的DNA分子,存在于细菌体中,独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造,实验室常用质粒被赋予了以下几种特性:
,可方便地插入目的DNA片段。
,即在实验中,可将质粒诱导入细菌。
。常用的有抗生素抗性基因。这样,一旦质粒进入细菌,便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力,在含这一抗生素的琼脂平板上传代。
,例如一种叫pUC的质粒,在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此,质粒已成为分子生物学中使用最为广泛的载体。
本实验介绍的质粒全长3000个碱基对(bp),在质粒的 10-110 bp段为多克隆位点区域,含有 Xba I、EcoR I、Kpn I、Sma I、Hind III、BamH I、Sac I等多种限制性内切酶的位点。
原理
采用由EcoR I切割开的pGEM-7质粒,以及由EcoR I切割大鼠促性腺激素释放激素(rGnRH)基因启动子并分离出的-171~-432 rGnRH DNA片段,用T4噬菌体DNA连接酶将GnRH启动子DNA片段与切割开质粒DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子,即把目的基因(GnRH启动子DNA)插入质粒DNA,实现质粒重组。
实验准备(略)
实验步骤
标记试管(内容、日期),插入碎冰,依次加入:
H2O 3 ul
50ng/ul pGEM-7 DNA 2 ul
5ng/ul -171- -432 rGnRH DNA 2 ul
盖上盖,放入45℃水浴×5min,插入冰内,开盖,再加入:
10×T4噬菌体DNA