文档介绍：实时荧光定量PCR(real time PCR)原理与实验操作
定量PCR技术:
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析
本底期、指数扩增期、平台期
Real-time PCR优点
特异性好(<2%CV of CT 值)
灵敏度高(<5copies)
线性关系好、线性范围宽(7-8 log)
操作简单、安全、自动化程度高、防污染
速度快、高通量
Real-time PCR概况
如何对起始模板定量?
通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析
引入两个概念:
荧光阈值、Ct值
荧光阈值
在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)
Threshold line
C(t) value
C(t) value
+/
-
Threshold line
C(t) value
C(t) value
+/
-
C(t) value
+/
-
C(t) value
+/
-
缺省设置:3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置:确定荧光阈值的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,
阈值的选择
Threshold line
C(t) value
C(t) value
+/
-
Threshold line
C(t) value
C(t) value
+/
-
C(t) value
+/
-
C(t) value
+/
-
Ct值的概念
Ct值的定义是PCR扩增过程中,扩增产物(荧光信号)到达阈值时(进入指数增长期)所经过的扩增循环次数
初始模板量越多, 扩增产物达到某一值(域值)时所需要的循环数越少
Log浓度与循环数呈线性关系
确定初始模板的浓度
理想的PCR反应:
X=X0*2n
非理想的PCR反应:
X=X0 (1+Ex)n
n:扩增反应的循环次数
X:第n次循环后的产物量
X0:初始模板量
Ex:扩增效率
定量原理
在扩增产物达到阈值线时:
XCt=X0 (1+Ex)Ct =N (1)
XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.
在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.
方程式(1)两边同时取对数得:
log N=log X0 (1+Ex)Ct (2)
整理方程式(2)得:
log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N (3)
Log浓度与循环数呈线性关系,根据样品扩增达
到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量