文档介绍：
第 16卷第 4期中国组织化学与细胞化学杂志 V o l
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N o. 4

2007年 8月 CH INESE JOURNAL OF H ISTOCHEM ISTRY AND CYTOCHEM ISTRY Aug. 2007
实时荧光定量 PCR 技术的原理及其应用研究进展
赵焕英
包金风*
(首都医科大学北京神经科学研究所, 北京市神经再生修复重点实验室, 教育部神经变性病重点实验室, 北京
100069)

关键词
实时荧光定量 PCR;
荧光标记探针;
DNA 结合染料

中图分类号
Q523
1
文献标识码
A

自从 1983 年 M u llis 发明聚合酶链式反应 10nm ), 报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸
( po lym erase cha in reaction , PCR) 以来, PCR 技术收, 并依赖其较高的 S /N 比值( 信
噪比, signal
很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统 to
noise ratio) 和良好的辨别能力进行定量检测。
PCR 技术在应用中一是不能准确定量, 二是容易 1
2实时荧光定量 PCR几个重要参数
交叉污染, 产生假阳性。直到近年来荧光共振能量
荧光域值( thresho ld) : 以 PCR 反应的前 15
转移( fluorescence resonance energy transfer , 个循环的荧光信号作为荧光本底信号, 一般荧光域
FRET ) 技术用于 PCR 定量后, 上述问题才得到较值定义为 3- 15 个循环的荧光信号的标准偏差的
好的解决[ 1] 。实时荧光定量 PCR ( rea l
tim e fluoro
10 倍。
C t值: 也称循环阈值, C 代表 Cycle, t
ic quantitative PCR , FQ
PCR) 是在 PCR 定性代表 threshold 。 C t值是指样品管的荧光信号达到
技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在某一固定阈值的 PCR 反应循环数。在 PCR 循环过
PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积程中, 即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的
累实时监测整个 PCR 进程, 最后通过标准曲线对拐点所对应的循环次数。在实际操作中, 这个时刻
未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的
对 DNA 模板的定量, 而且具有灵敏度高、特异性时刻, 可见 C t值取决于阈值。
Rn: 是指模板
和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、 DNA 的起始拷贝数(图 1所示)。经数学证明, Ct
无污染性、具实时性和准确性等特点, 目前已广泛值与模板 DNA 的起始拷贝数(
Rn ) 成反比。典
应用于分子生物学研究和医学研究等领域[ 2] 。型的 PCR分 4给阶段(图 2)。
1
实时荧光定量 PCR 技术的概述
1
1荧光共振能量转移原理
1992年 H iguch i等首次提出了采用动态 PCR
方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分
析, 荧光探针技术是基于标记基团的 FRET