文档介绍：固定化酶
深圳大学
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生物催化剂
细胞
酶
非生长
生长
可溶
固定化
悬浮
固定化
连续
间歇
吸附
包埋
交联
化学连续
材料
膜固定
酶液
凝胶
吸附
化学连接物
固定化行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。
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三、酶固定化技术
微型胶囊法
吸附法
胶格包埋法
共价交联法
共价偶联法
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1、微型胶囊法
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
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微型胶囊法制备固定化酶有两种方法
① 界面沉淀法
这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。
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②界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。
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2、吸附法
I 物理吸附法
静止法
电沉积法
反应器上直接吸附法
混合浴或振荡浴吸附法
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优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。
缺点：结合力弱，易解吸附。
载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等。
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II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载体相结合
第一个离子结合法固定化酶：
DEAE — Cellulose
固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶：
DEAE-Sephadex A-50
固定化氨基酰化酶
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3、胶格包埋法
首先被采用的胶格包埋法是：
固定化胰蛋白酶
木瓜蛋白酶
－淀粉酶
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰***, 丙稀酰***
引发剂－－inactiation
将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。
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4、共价交联法
5、共价偶联法
可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键
常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体
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共价键结合法制备固定化酶的“通式”
载体上引进活泼基团
活化该活泼基团
此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
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载体活化的方法
A．重氮法
B．叠氮法
C．烷基化反应法
D．硅烷化法
E．溴化***法
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A．重氮法
反应示意式如下
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A．重氮法
目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等
该方法需要载体具有芳香族氨基
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A．重氮法
反应式及原理
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B 叠氮法
例
用羧***纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：
⑴ 酯化
⑵ 肼解
⑶ 叠氮化
(4) 偶联
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B 叠氮法
对含有羧机基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚***活化，生成叠氮化合物。最后于酶偶联
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C．烷基化反应法
含羟基的载体可用三***三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。
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D．硅烷化法
一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。
多孔玻璃特点：
①机械强度好，表面积大。
②耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。
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D．硅烷化法
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D．硅烷化法
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D．硅烷化法
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E ．溴化***法
本方法主要用溴化***（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化***法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。
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E ．溴化***法
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双功能试剂：
常用的是戊二醛
O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶
4、共价交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。
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常用于固定化酶的交联剂
交联剂
戊二醛
二重氮联苯***－2，2‘－二磺酸
4，4‘－二***－3，3’－二硝基二苯砜
二苯基－4，4‘－二硫***酸－2，2’－二磺酸
1，5－二***－2，4－二硝基苯
酚－2，4－二磺酰***
3－甲氧基二苯基甲烷－4，4‘－二异***酸盐
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酶共价交联有