文档介绍：海洋微藻DNA条形码基因的评估及环境样本多样性分析和定量基因的开发学位论文完成同期:垒垡兰!(=羔指导教师签字:答辩委员会成员签字:万方数据谨以此论文献给我敬爱的导师和挚爱的家人以及所有帮助和关心我的老师、同学和朋友?一郭立亮。?’孑I)j-L冗万方数据IllJlUY2900466独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得l注;翅遗查基丝霞墓挂别壹明的:奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:督立柚签字日期:a。I多年占月弓日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,并同意以下事项:,允许论文被查阅和借阅。,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”Ⅺ《中国知识资源总库》,授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名:由王屯导师粹n功L签字日期:Ⅺl多年6月≥日签字日期:弘l芏年6月;日万方数据海洋微藻DNA条形码基因的评估及环境样本多样性分析和定量基因的开发摘要海洋微藻不仅在海洋生态系统中占有十分重要的生态地位,而且其结构成分和分泌物等是巨大的可开发利用的海洋资源,而硅藻和甲藻是海洋微藻的主要类群,因此,对其进行准确地分类鉴定是其他相关工作的研究基础。DNA条形码技术作为传统分类学鉴定的补充手段发挥了非常重要的作用。但硅藻和甲藻的DNA条形码研究起步较晚,尚未找到分别适合的统一的DNA条形码基因,现有的研究也主要是分别针对特定的分类单元进行条形码基因的检测,并未在整个类群上对候选基因进行过评估。此外,目前对海洋微藻群落结构的研究,一是显微镜检,但该方法受限于形态学鉴定的局限性,二是利用rDNA的扩增子测序信息来反映群落中微藻的组成结构,但rDNA在不同真核生物中的的拷贝数差异很大。因此根据rDNA扩增子测序所得的序列丰度对环境样本中真核微生物群落的相应物种的丰度评估可能存在误差。一些拷贝数较少的核编码的蛋白基因己被用于甲藻的系统发育分析,将此类基因用于群落结构分析,结果应该会更加准确。因而,本文针对研究较为广泛的硅藻,对选取的候选条形码基因18SrDNA、ITSrDNA、C01和rbcL,分别进行通用引物的设计和验证,联合NCBI上的序列计算硅藻门各基因的遗传差异并构建贝叶斯树,评估其在硅藻门内物种的聚类情况,以分析各段标记适用于硅藻聚类关系中的分类单位;然后利用硅藻模拟混合样本进行rDNA扩增子克隆测序,评估rDNA序列的丰度反应环境样本中真核微生物群落的相应物种丰度的准确性;并对具有一定的甲藻物种区分能力的拷贝数较低的核编码蛋白基因(HSP90、e/f2、actin)设计通用引物,分析其对甲藻物种的区分度后,利用甲藻模拟群落和选定的actin基因构建克隆文库初步评估该基因对甲藻物种进行定量的准确性;最后比较18Sv9区和actin基因的Miseq测序测序结果,进行硅藻和甲藻模拟群落的物种丰度和多样性分析,并建立基因序列与生物量之间的关系。得到的结果如下:利用设计的通用引物将18SrDNA、ITSrDNA、C01和而吐基因在分离的37株硅藻中均获得了扩增和测序,测得的序列Blast结果显示,而吐基因的正确万方数据率最高(88。9%),18S次之,而COI的错误率最高(25%)。遗传差异和构建的贝叶斯树显示,18SrDNA的遗传变异度比较适中,可以在较高的分类水平上对硅藻进行聚类,也可以对直链藻属、楔形藻属、骨条藻属和双肋藻科等较低分类单位进行聚类分析。ITS和COI基因在硅藻门内遗传变异的程度很大,不再适用于较高分类单位的聚类分析,但是ITS适合用于海链藻目物种的DNA条形码鉴定和系统发育分析,而COI则更适合于羽纹硅藻的一些属的物种聚类分析和DNA条形码鉴定。而吐基因相对18S更加保守,但是并不能在高分类阶元上进行硅藻的聚类分析,却可以聚类异极藻属、骨条藻属、冠盘藻科和根管藻科等个别较低分类单位的物种序列。利用rDNA扩增子测序进行微藻群落中物种丰度的分析结果,以DNA为模板比以藻液为模板所构建的克隆文库检测到的物种多,但都只检测出少量物种并存在相同的物种扩增偏好性,且两个文库检测到的物种的比例与样本的细胞比例差异很大,一方面说明rDNA在不同硅藻物种中的拷贝数存在很大差异,另