文档介绍：外植体的选择和灭菌
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第一节外植体的选择
第二节外植体的灭菌方法
第三节污染原因和预防措施
第三章外植体的选择和灭菌
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第一节外植体的选择
培养基灭菌不彻底
操作人员未遵守操作规程
因此接种人员的手应经常用70%酒精精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。
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真菌污染的特点：
污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～10天才能发现。
原因：周围环境不清洁
超净工作台的过滤装置失效
培养用器皿的口径过大等
为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。
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污染后的措施
发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。
对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。
要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。
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2 污染的防治措施
防止材料带菌的措施
外植体的灭菌
玻璃器皿的灭菌
金属器械的灭菌
布质制品的灭菌
无菌操作室的灭菌
操作
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防止材料带菌的措施
（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对
枝条先进行预培养。
枝条插入无糖的营养液或自来水，以新抽嫩枝条作为外植体；
或暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时采枝接种。
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（2）选择合适的时间去田间采取外植体
避免阴雨天去田间采取外植体。
在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。
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但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。
在菌类长入组织内部时，不要去年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，可以收到一定的防污染效果。
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外植体的灭菌
（1）多次灭菌法：如咖啡成熟叶片的灭菌。
除去主脉、叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大大减少污染；
消毒处理
次日再次消毒
对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌，
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（2）多种药液交替浸泡法
对容易污染而难灭菌的材料：
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玻璃器皿的灭菌
湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。
干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。
煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。
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金属器械的灭菌
火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。
这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。
干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
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湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，（即15磅/英寸2），121 ℃的温度，灭菌20 min～30min。
布质制品的灭菌
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无菌操作室的灭菌
无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。
使用前用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。
一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。
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操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行
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防止操作带来的污染
A、整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速
正确错误
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B、接种过程中尽可能达到悬空要求
防止操作带来的污染
正确错误
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C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口
防止操作带来的污染
正确错误
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小结：常用的灭菌方法
物理方法
化学方法
干热灭菌(烘烧和灼烧)