文档介绍：高效液相色谱分析
1、概述
2、基本理论和条件选择
3、 HPLC分离方法
4、高效液相色谱仪
5、分离类型的选择
6、毛细管电泳
3-1 概述
高效液相色谱(HPLC)是一种以液体为流动相的快速分离分析色谱技术,采用细微粒固定相、高压输液泵和高灵敏度检测器,具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点,对于那些沸点高,热稳定性差,相对分子质量大的有机化合物如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物(类固醇化合物) 、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。
(滤棒,可滤
去颗粒状物质)
(输液泵)
——分离
——分析
高效液相色谱仪流程图
3-1-1 HPLC类型
液液分配色谱:流动相和固定相都是液体。
吸附色谱(液固色谱):流动相为液体,固定相为吸附剂。
离子交换色谱:此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合,测定各类阴、阳离子的分离分析方法。
离子对色谱法:将与溶质分子电荷相反的离子加入固定相或流动相,使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物,控制溶质离子的保留行为。
离子色谱法:分离水溶液中混合阴离子快速、灵敏、准确的最有效分析方法。
尺寸排阻色谱:基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。
3-1-2高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高压:HPlC供液压力和进样压力都很高(150~350X105Pa)。高压是的一个突出特点。
高速:HPLC采用高压输液设备,流速大大增加,分析速度极快,只需数分钟;而经典方法靠重力加料,完成一次分析需时数小时。
高效:填充物颗粒极细且规则,固定相涂渍均匀、传质阻力小,因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。大于30000塔板/米。
高灵敏度:检测器灵敏度极高:UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。
3-1-3 HPLC与GC的比较
分析对象及范围:GC分析只限于气体和低沸点的稳定有机化合物(占总数的20%);HPLC可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定有机化合物(占80%)。
流动相的选择:GC采用的流动相为几种“惰性”气体,只起运载作用,对组分作用小;HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合(供选择的机会多)。它除了起运载作用外,还可与组分作用,并与固定相对组分的作用产生竞争,即流动相对分离的贡献很大,可通过溶剂来控制和改进分离。
操作温度:GC需高温;HPLC通常在室温下进行。
3-2 基本理论和条件选择
3-2-1 H-u曲线
HPLC与GC基本概念和理论基础一致,但也有不同。速率理论 H=A+B/u+Cu
涡流扩散项:A = 2dp 含义与GC一样。
纵向扩散项:液体的扩散系数Dm比气体小4个数量级,当流动相线速度u>-1时可忽略.
传质阻力项:三个部分组成,固定相传质阻力项,流动的流动相阻力项及滞留的流动相阻力项。
3-2-1 H-u曲线
3-2-2 分离条件
固定相与装柱方法的选择:选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp≤10μm),首选化学键合相,匀浆法装柱。
流动相及其流速的选择:选粘度小、低流速的流动相——甲醇,约1ml/min 。
柱温的选择:选室温250C左右。
3-3 HPLC分离方法
3-3-1 液液分配色谱法(LLC)
原理:根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同,因而具不同的分配系数。在色谱柱中,随着流动相的移动,这种分配平衡需进行多次,造成各待测物的迁移速率不同,从而实现分离的过程。
固定相:原则上,用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失,因此常用的只有几种,按极性由高到低为:,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、角鲨烷(SQ)。通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相。
化学键合固定相:通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂,具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。
流动相:根据流动相与固定相极性的差别程度,可将液液色谱分为正相分配色谱和反相分配色谱。