文档介绍：实验十酶联免疫吸附试验
ELISA-间接法
此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图。
酶标抗体
固相抗原
待测抗体
E
实验十酶联免疫吸附试验
ELISA-间接法
此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图。
酶标抗体
固相抗原
待测抗体
E
E
E
ELISA间接法示意图
底物
用于抗原及半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。
以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体上，加入待测抗原和一定量的已知酶标抗原，使二者竞争地与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。
固相抗体
E
E
E
酶标抗原待测抗原
E
底物
E
显色反应（弱）
固相抗体
E
E
E
酶标抗原
底物
显色反应（强）
E
E
E
E
E
E
ELISA-竞争法
ELISA-双抗体夹心法
双抗体夹心法常用于检测抗原。
将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标本(含相应抗原)与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体及底物溶液进行测定。
酶标抗体
固相抗体
待测抗原
E
E
E
双抗体夹心法检测抗原
实验材料
1、乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒
定性检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。
包括：
HBsAg特异性抗体（一抗）已包被于酶标板上
HBsAg阴、阳性血清各1份、
酶标抗体（二抗）1份，
显色剂A、B各1份，终止液1份，洗涤液1份，
2、待检血清5份
3、微量加样器（10-100ul）及匹配的枪头
4、废液缸
注意：有污染性。
夹心法检测HBsAg方法
由于抗体1已包被在酶标板上，故直接从加抗原开始。
1、加样：每组2条8孔，待检8孔，阴性对照、阳性对照、空白对照各1孔。分别加75ul待测样本和阴、阳性对照于相应孔内，盖封板膜，置37℃恒温箱温育60分钟。2、加酶标抗体：除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板，置37℃水浴箱温育30分钟。3、洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上拍干。4、显色：每孔加底物液A 、B 各1滴（50ul），轻拍混匀，置37℃避光显色30分钟，肉眼观察。5、终止：每孔加终止液1滴（50ul），轻拍混匀。在10分钟内酶标6、测定：用酶标仪（波长450nm）测定各孔吸光度OD值。
酶：辣根过氧化物酶(HRP)
底物：3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）
在辣根过氧化物酶催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。使用2M  H2SO4终止反应，在450nm测定吸光度。
结果判断
1、定性：夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。
2、P/N值≥；P/N值＜。介于中间为可疑。
S：待测样本OD值
COV： cut-off value =NCx+
NCx：阴性对照OD值的均值
阳性判定值=S/COV
≧：阳性
﹤：阴性
实验报告
1、计算5个待测样本的S/COV，判断结果
2、本实验中采用的酶、底物及反应原理。
实验十 IgG的分离和纯化
实验目的
实践IgG分离纯化过程
了解分离、纯化抗体的原理
比较成年牛血清与新生牛血清中IgG的含量（眼观）
实验原理
利用蛋白质盐析原理，分离血清中的IgG:

不同蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，因此，可利用不同浓度的盐溶液使血清中的各个蛋白质成分分别析出。
血清蛋白质：复杂混合物。
1、白蛋白、a1、a2、β球蛋白，纤维蛋白原，凝血酶原和其它凝血因子等均由肝细胞合成。
2、γ球蛋白主要来自浆细胞。
免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（γ-球蛋白）中。
免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。
，50％硫酸铵饱和度可将所有的5种Ig（球蛋白）沉淀出来。33％饱和度大部分IgG可沉淀出来。
意义：制备出的纯化IgG，可用于酶标抗体或荧光抗体的制备。
实验器材
1．动物抗血