文档介绍：实验九 酶联免疫吸附试验-ELISA 实验十 IgG的分离和纯化
程 燕
2014年6月9日
实验九 酶联免疫吸附试 （ Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
实验目的
1实验九 酶联免疫吸附试验-ELISA 实验十 IgG的分离和纯化
程 燕
2014年6月9日
实验九 酶联免疫吸附试 （ Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
实验目的
、种类和用途。
（HBsAg）的方法。
。
实验原理
将已知抗体（或抗原）结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。
测定时将待检标本和酶标抗体（或酶标抗原）按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体（或抗原）发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。
实验原理
ELISA的基本原理有三条： 
（1）抗原或抗体能以物理性（疏水性）地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
实验原理
常用酶联免疫吸附试验有
间接法
竞争法
双抗体夹心法
ELISA-间接法
此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图。
酶标抗体
固相抗原
待测抗体
E
E
E
ELISA间接法示意图
底物
用于抗原及半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。
以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体上，加入待测抗原和一定量的已知酶标抗原，使二者竞争地与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。
固相抗体
E
E
E
酶标抗原待测抗原
E
底物
E
显色反应（弱）
固相抗体
E
E
E
酶标抗原
底物
显色反应（强）
E
E
E
E
E
E
ELISA-竞争法
ELISA-双抗体夹心法
双抗体夹心法常用于检测抗原。
将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标本(含相应抗原)与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体及底物溶液进行测定。
酶标抗体
固相抗体
待测抗原
E
E
E
双抗体夹心法检测抗原
实验材料
1、乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒
定性检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。
包括：
HBsAg特异性抗体（一抗）已包被于酶标板上
HBsAg阴、阳性血清各1份、
酶标抗体（二抗）1份，
显色剂A、B各1份，终止液1份，洗涤液1份，
2、待检血清5份
3、微量加样器（10-100ul）及匹配的枪头
4、废液缸
注意：有污染性。
夹心法检测HBsAg方法
由于抗体1已包被在酶标板上，故直接从加抗原开始。
1、加样：每组2条8孔，待检8孔，阴性对照、阳性对照、空白对照各1孔。分别加75ul待测样本和阴、阳性对照于相应孔内，盖封板膜，置37℃恒温箱温育60分钟。 2、加酶标抗体： 除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板， 置37℃水浴箱温育30分钟。 3、洗涤： 用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上拍干。 4、显色： 每孔加底物液A 、B 各1滴（50ul），轻拍混匀，置37℃避光显色30分钟，肉眼观察。 5、终止：每孔加终止液1滴（50ul），轻拍混匀。在10分钟内酶标 6、测定：用酶标仪（波长450nm）测定各孔吸光度OD值。
酶：辣根过氧化物酶(HRP)
底物：3,3‘,5,5’-四***联苯***（TMB）
在辣根过氧化物酶催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。使用2M  H2SO4终止反应，在 450nm测定吸光度。
结果判断
1、定性：夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。