文档介绍：实验四、五：目的基因的PCR扩增
一、实验目的
1. 教学目的：PCR反应、产物检测的基本原理与实验技术
：具有PCR扩增体系设计、参数设置基本能力，掌握扩增产物检测方法
二、实验原理
(聚合酶链式实验四、五：目的基因的PCR扩增
一、实验目的
1. 教学目的：PCR反应、产物检测的基本原理与实验技术
：具有PCR扩增体系设计、参数设置基本能力，掌握扩增产物检测方法
二、实验原理
(聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)原理:体外快速扩增特定基因或DNA序列
PCR动画
***凝胶检测原理
聚丙烯酰***凝胶有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰***的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰***形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰***交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成DNA分子通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰***～丙烯酰***” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。聚丙烯酰***凝胶大多按“双丙烯酰***～丙烯酰***”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有1-2bp 的DNA
三、仪器、材料和试剂
(一)仪器
PCR扩增仪、 琼脂糖凝胶电泳系统（琼脂糖水平电泳槽和电泳仪）、紫外透射仪或凝胶成像分析系统、移液器（2,10,20,200,1000μl）、磁力搅拌器、垂直板电泳槽、水平摇床、枪头等耗材。
（二）试剂、材料
：10×PCR缓冲液(含Mg2＋) 、 dNTP混合物、 Taq酶、质粒DNA模板、引物对（正向引物和反向引物） 、PCR 管、丙烯酰***、过硫酸***、N,N,N’,N’-四***二乙***（TEMED）、Tris碱、硼酸、Na2EDTA·2H2O、冰醋酸、无水乙醇、Na2OH、AgNO3、甲醛、10 m mol/L dNTP混合物、 5U/uL Taq DNA聚合酶、10× PCR Buffer、50xTAE、引物对（鲤微卫星引物对）、过硫酸铵。
：1ng/ uL DNA模板
：引物对筛选。（说明，该引物对为教师科研过程中筛选引物对，参考文献：岳兴建, 邹远超，. 生态学报. 2019, 33(13).）
5×TBE 、10%过硫酸铵(AP) 、30%丙烯酰***母液
四、实验步骤 (一)PCR
6个样本/同学，建议编制8个样本量以便分样
取样后要标记
***凝胶的制备与电泳
(1)清洗制胶玻璃板，烘干后，组装玻璃板，%的琼脂糖封底；
(2)按照配方表将各组分混匀，混匀后迅速灌胶；（注意防止气泡产生）
(3) cm 时停止灌胶，插入梳子，注意梳齿下不能有气泡，室温下聚合1～3小时；
(4)凝胶聚合完全后，轻轻拔出梳子；
(5)在PCR产物中加入5 μL左右上样缓冲液，用微量进样器取8μL混合液，加到点样孔，同时留出1个点样孔加入分子量标记物Marker
***凝胶电泳的银染检测（4步）
参考文献：梁宏伟，王长忠，李忠，等. 聚丙烯酰***凝胶快速、,30（10）.
1)电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳缓冲液1×TBE，取出凝胶，剥到染色盒中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中漂洗1一2次,1-2min/次；
(2)固定：加入固定液，在摇床上轻摇固定30min，把固定液倒入到一个容器中，以便做终止使用；用双蒸水洗2次，每次漂洗时间不超过1min，洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸水；（通常有这步，?见通过染色液、固定液配方分析）
(3)染色：加入染色液，在摇床上轻摇染色20min，然后双蒸水迅速漂洗2次，每次漂洗时间不超过20s，漂洗过程中缓慢摇动，倒去双蒸水；
(4)显色：加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察显色情况，出现比较清晰的条带时就停止显色，然后双蒸水迅速漂洗2次（通常是这样操作，我们使用自来水冲洗，便可省掉下一步。Why?），洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸水；
(5)终止显色：把最初使用的固定液加入染色盒中，缓慢摇动5min，倒掉终止液，然后用双蒸水洗胶三遍，洗的过程中缓慢摇动，每次1min；
(6)拍照：将胶置于凝胶成相系统上，白光下用数码相机进行拍照，保存照片用于带型分析。
1）电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳缓冲液1×TBE，取出凝胶，剥到染色盒中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中漂洗1一2次,1-2min/次；
3)染色：加入染色液，在摇床上轻摇染色20min，然后双蒸水迅速漂洗2次，每次漂洗时间不超过20s，漂洗过程中缓慢摇动，倒去双蒸水