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生物技术制药
第一章绪论
药学一级学科分类：药物化学、药剂学、药理学、药物分析、生药学及微生物与细胞的能力。
质粒载体：共价闭合环状DNA(cccDNA)；开环DNA(ocDNA)；线状DNA(lDNA)
质粒的三个重要性质：遗传传递的能力；遗传交换的能力；不相容性
用于克隆的质粒的三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点
常用质粒载体：克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体
λ噬菌体载体：插入型载体、置换载体
来源于噬菌体DNA，因可以插入较大DNA片段，常用于构建基因组文库和cDNA文库。
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目的基因的常用制备方法
化学合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于100bp的片段：直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法
PCR法：前提：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
基因文库法：鸟枪法：适用于原核细菌目的基因的克隆分离
cDNA文库法(与mRNA互补的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；仅限于克隆蛋白质编码基因；mRNA含量少且t1/2短，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难
第一链：mRNA模板，引物 (polyT) ，逆转录酶，dNTPs
第二链：自身引导法：取得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失(NaOH，煮沸；Klenow酶，dNTPs；S1内切酶)
引导合成法：获得的cDNA能保持完整的5’端序列(TdT, Dctp；NaOH；退火；Klenow酶，dNTPs)
基因文库的完备性：指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N= ln(1–P) /ln(1–f)，P=完备性，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小
双酶切产生的粘性末端，最常用，可以确保连接方向的正确性
影响连接效率的因素：连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1；连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系
重组DNA导入宿主细胞
导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法
导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法
导入链霉菌：原生质转化法；电穿孔法
重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE葡聚糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法
重组子的筛选与鉴定
遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法；α互补筛选法(蓝白斑筛选——载体含有LacZα基因，X-gal培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法
核酸分子杂交法：菌落原位杂交法；DNA印迹法；RNA印迹法
限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆
DNA序列测定法
目的基因表达产物测定法
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原核细胞表达的特点及选择
大肠杆菌(首选,遗传背景研究清楚；适合大规模生产(成本低，周期短，效率高，操作简单)、芽孢杆菌、链霉菌等
缺点：缺乏翻译后修饰系统；容易以包涵体形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系统水解
★ 外源基因表达的调控原件：复制子、启动子(表达效率的关键因素)和终止子、核糖体结合位点(即SD序列及SD序列到起始密码子AUG的距离)、识别翻译后修饰信号
用于原核表达的载体必须具备的条件：具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子(一般有)、强的终止子，所产生的mRNA应具有翻译起始信号(起始密码子AUG以及SD序列)
★ 外源基因在大肠杆菌中的表达方式
胞内表达：
非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态，易被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因
融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白
分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达
★ 外源蛋白表达效率的影响因素
外源基因密码子：大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子，外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子
mRNA的结构：改变一级结构；降低5’端二级结构稳定性；调控3’端非翻译区二级结构
表达载体的选择：表达方式；强的复制子(拷贝数高)；强的启动子(转录效率高)；高效率的核糖体结合位点；强的终止子(提高mRNA稳定性)；适应范围广；稳定性高；产物