文档介绍：蛋白质纯化实验实验技术简介：双向电泳(two-dimensional electrophoresis)是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离)，然后再进行 SDS-PAGE (按照分子大小)，经染色得nB12 (1350) 三、管柱装填
以纯水冲洗玻璃管柱（以纯水上下冲洗即可，严禁使用试管刷）；并请了解管柱的构造与拆装方法，垂直架好管柱，以软管连接部分收集器，并以 bufferA-150 试看管路是否通畅；可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管，则可控制溶离的进行。注意系统的摆设要适当，不要装置于交通要冲。
依预估量取出 Sephacryl 胶体，注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡；将瓶中的胶体上下震荡，使的完全悬浮，但勿产生太多气泡。
在管柱内加入约 10 cm 高缓冲液，然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱，一直加到管柱顶端，开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时，可于顶端添加胶体，以达所要高度；胶体高度约
90 cm。
胶体完全沈降后，小心以 buffer A-150 加满管柱，关闭出口，装上顶端端盖并连通缓冲液瓶，打开出口以重力流洗。调整缓冲液瓶高度，使流速约每五~六秒一滴，并设定收集体积为 mL/tube。
胶柱流洗约100 mL 后，关闭出口，拆开顶端端盖，先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约 1 cm 高，注意勿破坏胶体表面平整；然后打开出口，使液面下降至胶体面，再关闭出口，准备注入样本。
四、样本色析进行
以微量移液器或滴管吸取样本（样本体积不得超过胶体总体积的 3%），沿着胶体上方管壁缓慢加入，注意切勿破坏胶体的平整表面！（样本确实体积 mL）
打开出口，同时开启部分收集器；当样本完全没入胶体时，关闭出口，缓缓加入与样本相等体积的buffer A-150，打开出口待其慢慢进入胶体中，如此重复二次。不得扰动胶体表面，造成凹陷。
暂时关闭出口，将液面高度加满至管柱顶端，并把顶端端盖锁上；然后打开出口开始溶离，调整缓冲液瓶的高度，使流速为6 s 一滴。
要留心观察前面几个分划，确定整个系统运转无碍，小心部分收集器最容易出问题。管柱预计将流洗过夜，收集约 80 管。
1. 收集试管，进行蛋白质定量分析以及 GUS 活性测定，并请作图。
收集 GUS 活性区，以 Centriprep-30 浓缩至 10 mL 后，加 buffer A-0 稀释至 20
mL,再次浓缩至 mL （GF），保留100 “。
管柱请再以 buffer A-150 流洗 100 mL 后，小心放置一旁，准备以后进行分子量测定。
五、分子量测定
进行分子量测定前一天，请先以buffer A-150流洗100 mL，并检查胶柱内有无气泡产生，若有严重的气泡或干裂，必须重新装填管柱。
mL, mL （以亲和层析法所得的 AF 部份），如上法注入管柱中，立刻开始进行胶体过滤，并收集各分划。请依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。
收集所得，进行蛋白质定量分析，可定出数个蛋白质尖峰，以作为分子量依据；另以目测法，决定红色高峰的管数，则可定出 vitamin B12 的溶离管数。利用以上数据，