文档介绍：电子显微镜使用方法五、电镜标本制作方法电镜标本用于观察组织细胞的超微结构。扫描电镜用于细胞表面的观察, 透射电镜用于细胞内部结构的观察。现以透射电镜标本的制作为例作简要介绍: (一) 取材标本的新鲜程度要求高于光镜标本,组织块小于 lmm3 。(二) 固定常用的固定液有 %戊二醛磷酸缓冲液和 1 %锇酸。这些液体穿透力较强,能稳定和保存细胞内的结构。固定温度应控制在 0~ 4℃,固定时间 1~2 小时。(三) 冲洗冲洗液由 0. 2mol /L 磷酸缓冲液() 与双蒸水等量混合配成。冲洗组织块 2 15 分钟。(四) 脱水脱水剂多采用浓度递增的酒精和***,从 50% 70% 90 %酒精 1/2 90 %酒精+1/2 90 %***混合液 90 %***( 以上步骤均在 0~4 ℃冰箱中进行) 100 %***,间隔 10~15 分钟。(五) 包埋包埋剂为环氧树脂 618 或 812 和固化剂十二碳烯基丁二酸酐( 简称 DD-SA) , 加入适量增塑剂苯甲酸二丁酯( 简称 DDP) 。为了使反应速度增快,可加入加速剂 2,4, 6-三[( 二甲氨基) ***] 苯酚( 简称 DMP-30) 。包埋剂配方: 环氧树脂 618 或 812 60% DDSA 40% DBP 3% DMP-30 1% 上述试剂依次加入,边加边搅拌,全部加完后再充分搅拌 10~ 15分钟,静置于 35~40 ℃温箱内排出气泡。包埋前组织块必须浸透,入无水***加等体积包埋剂室温 3 小时,纯包埋剂 37℃2 小时。包埋时先将纯包埋剂倒入胶囊或含硅胶的包埋槽内, 置入组织块。包埋后在 60C 温箱中烘 2~3 天后硬化成块,即可剥去胶囊或包埋槽。(六) 将组织块修成塔形,尖端面积为 × 左右,用超薄切片机切成 50mm 厚的超薄切片,再置于铜网上。(七) 染色常用的染液有 1~2 %醋酸铀和枸橼酸铅。醋酸铀染色是在组织块进行脱水过程中进行的, 而枸橼酸铅染色则多用于片染。最后, 将载有切片的铜网置于透射电镜内观察和摄影。由于电镜电子束穿透能力的限制, 必须把标本切成厚度小于以下的薄片才适用,这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是 50-70nm 。在透射电镜的样品制备方法中, 超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似,需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。一取材的基本要求组织从生物活体取下以后, 如果不立即进行适当处理, 会由于细胞内部各种酶的作用, 出现细胞自溶现象。此外, 还可能由于污染, 微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏。因此, 为了使细胞结构尽可能保持生前状态,必须做到快、小、准、冷: (1) . 动作迅速, 组织从活体取下后应在最短时间内( 争取在 1 分钟内) 投入 % 戊二醛固定液。(2) .所取组织的体积要小,一般不超过 1mm × 1mm × 1mm 。也可将组织修成 1mm × 1mm × 2mm 大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱, 组织块如果太大,块的内部将不能得到良好的固定。(3) . 机械损伤要小, 解剖器械应锋利, 操作宜轻, 避免牵拉、挫伤与挤压。(4) .操作最好在低温(0℃~4℃) 下进行,以降低酶的活性,