文档介绍：------------------------------------------------------------------------------------------------ —————————————————————————————————————— western-blot 条带分析及解决方法 Western 条带分析及解决方法--- 刘健锋 Western 条带分析及解决方法--- 刘健锋*注1 其具体问题有二:一是背景较高, 二是没有条带. 形成机制为条带处 HRP 很快将底物耗竭,则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景 HRP 较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/ 洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因 3 的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决, 要么动作迅速早期未耗竭底物时压片, 否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿 RP 稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊, 但条带中心是空的白色,原因和上面的一样,主要是条带中心耗竭底物引起的, 也可以在暗室看到中空的荧光带, 但与上面的区别主要在于特异性要好一些,若继续发展则就是原因 3 的现象。其分析和解决同上。 Western 条带分析及解决方法--- 刘健锋*注2 其原因主要是 HR P 太高超速催化底物生成的产物使膜发黄, 压出的片子可以是正常的或和原因 1 或原因 3 的现象同时存在, 只是一种现象,在压过的膜可以看出来( 只在加底物后一段时间出现, 几小时后可能还会消退, 有时甚至刚加底物 1~2min 就可以看出来, 所以要把握时机)。------------------------------------------------------------------------------------------------ ——————————————————————————————————————如果没有达到原因 1 和原因 3 的程度, 那么这种情况一定能够看到很强的荧光,是一种良好的状态, 是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因 1 和原因 3 的现象, 可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大, 所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决,一般压 10s~30s ,甚至可以 3~5s ,即时根据结果在暗室调整, 荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况, 就是由于 HRP 过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大(如果时间过短如<3s 则可因感光不足导致条带太淡, 这样就不可取了, 但依然是粗大的、非条带的本来面目) ,那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度( 减少上样量很不稳定且能力有限, 故很少使用)来解决。原因 1和3 若如是则解决也是一样的。*注3 这是与 1 类似但抗体特异性较好时的一种表现, 经常与下面的原因 4、5、6 混淆,特别需要注意。主要出现在 HRP 极高的情况下,来不及压片就已耗竭底物, 往往伴有原因 2 的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定, 也可以根据原因 2 的现象确定, 以区分于原因 4、5、6 。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦