文档介绍：MTT法检测细胞活力
甘肃中医药大学
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MTT法目的和意义
检测细胞存活和生长情况
用于评价药物产生的细胞毒作用
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原理
四唑盐〔噻唑蓝〕是一种能接受氢原子的染料，简称MTT
1 lgI==1 lgIC50=-1-1*(-(3--)/4)=- IC50=
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本卷须知
1． 选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。 2．  设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。
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实验前应明确的问题
。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否那么细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
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。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否那么，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了〔到了平台期〕那个时间点应该就是最好的时间点〔因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显〕。
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。100ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
 
，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。
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，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二***亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二***亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组参加不同浓度的药物。
 
。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内剩余培养液。
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关于细胞的接种(铺板)
细胞过了30代以后就不要用了;培养板要用好的〔最好进口板〕，不好的板或重复利用的板只可做预实验。
接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定。 悬浮细胞每孔的细胞数可到达105,贴壁细胞可为103-104。
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MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
注意细胞悬液一定要混匀，已防止细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量防止人为误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。
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如何去除上清
直接吸出：加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟，然后吸掉上清(如果是悬浮细胞，那么推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×,去除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃150-160ul即可)。
翻转倒扣法：可以直接将板翻转倒扣〔垫几层滤纸〕2－3次，比用“吸〞的方法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，但前提是细胞贴壁要比较牢。
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参加DMSO
在同一批实验中最好不要更换DMSO。加DMSO前把孔中液体尽量弃干净如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul.
加了DMSO后用振荡器轻轻振荡5－10min, 时间控制尽量严格一点,放置时间长了会