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生物工翟学报:—;
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巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶基因的克隆和表达
张兰芳李忠伟张其玖
中国科学硫生物物理研究所,北京
中国科学院应用生态研究所, 沈阳
我们分离列了一株产生分泌型青霉素酰化酶的巨大芽孢杆菌
。用作载体,将该菌的青霉素靛化酶基因克隆至大肠杆菌
甲,。分析了该质粒的限制酶酶切图
谱,。和在·。
中均能表选,表达受苯乙酸诱导。
关键词青霉素酰匕酶基田克隆’表达巨大芽孢杆菌
在产生青霉素酰化酶的众多微生物所用的细菌和质粒列于表
中, 研究和工业应用最多的是大肠杆菌培养基硬化学药品
和巨大芽孢杆菌。。的常用培养
能将青霉素酰化酶分泌到细基为和培养基。一硝基一一苯乙
胞外】,这种特性对酶的工业化提取十酰胺基苯甲酸购自上海东风试
分有利。建立高产和分泌型的酶产剂厂。限制酶、连接酶等从美
国和西德—
●生菌是一个重要课题。国际上, 有关巨大
芽孢扦菌的工业生产及研究常用的公司购进,细菌磷酸单酯酶, 溶菌
菌株是及其衍生株, 坦关于酶,琼脂糖等为中国科学院生物物理研究
其酶的遗传分析却报道不多。所生化厂产品。其他化学试剂均系市销分
曾从的高产析纯。
突变椿中克隆到一个. 的三的操作
片段,能够使的产量提高, 但。染色体的
没有获的结构基因。制备基本上参孝文献的方法进行, 所
等首次报道成功地克隆到得制品经过和水
突变株的结构基因, 但是克隆的基解,再经柱层析分离, 得纯
固在. 中表达十分微弱, 且检测不净的。质粒的制备按照
到分泌到细胞外的酶活性、我们分离到了等的方法, 大量提取采用梯
一株产生分酶的甘. 度超离心法, 小量提取采用
, 本文介绍该菌株基因的克隆裂解法。酶切片段的分离与收集采用
。
奉文于年月日收到.
材料和方法中国科学院做生物研究所蔡妙荛同志协助鉴定
一细菌和质粒酋择, 在此取谢
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生工程学捉卷
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丧细苗和质垃

细菌基因型来源或参考
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基因克隆在上;
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基因克隆在
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低融点琼脂糖凝胶电泳法。限制酶酶应和试验阴性, 腽于典型的.
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切、脱磷、连接、转化细胞的制备和质粒菌株】。
的转化等均按的方法。. 的青霉素酰化
四青霉素砖化酶基因克隆的筛选酶基因克隆的程序如图所示。染色体
采用试纸法阳性菌落直接经部分水解,
从试纸上挑出。用完全阵解后再用脱去末端
五青霉素砖化爵活性的测定磷酸基团, 降解的染色体与载体经
的定量测定, 以为底连接酶连接后转化. ●
物, 基本上按文献进行。,潦布在含有/的氧苄青
霉素的琼脂培养基上。用试
结果纸法在大约个转化子中筛选到个
阳性菌落。为使该克隆纯化, 从这