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海洋微生物高通量培养和分选技术的建立及应用学位论文完成日期:至记抑林鞯指导教师签字:答辩委员会成员签字:
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峙驯学位论文作者虢囊也奇签字魄砂匀,瑗~㈣协侈归扩日者沙独创声学位论文版权使用授权书明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》,并通过网络向社会公众提供信息服务。C艿难宦畚脑诮饷芎笫视帽臼谌ㄊ导师签字:签字日期:名年签文期论日位字学签一
海洋微生物高通量培养和分选技术的建立及应用摘要目前普遍认为海洋微生物能被分离培养的还不到ィ绾慰焖俅罅康卮雍洋环境中获得微生物纯培养成为该学科研究的“瓶颈”。研究发现,经典的平板培养方法不适合于大多数海洋微生物的培养,今后海洋微生物学领域的重要课题之一就是寻找难培养海洋微生物的培养方法。为建立海洋微生物的新的分离培养技术,本论文按以下研究内容展开:包埋活细胞的微球制备技术的建立、海洋微生物高通量培养和分选方法的建立与应用以及一株海洋新菌的分类鉴定。本论文以活细胞的微包埋为前提,建立了三种微球制备方法,分别为搅拌乳化法、两相共流法和膜乳化法。三种方法均可以采用多种天然高分子聚合物琼脂糖、褐藻酸钠和结冷胶票赋隽>毒坏奈⑶颍渲票腹ひ占虻ァ⑻跫和,适合活生物细胞的包埋。所建立的微球制备技术也可应用于其它领域。在所建立的微球制备技术基础上,进一步建立了海洋微生物的高通量培养和分选技术。该技术的基本步骤是,首先采集海洋微生物样品,采用离心和滤膜过滤法浓缩微生物,将浓缩的微生物细胞进行微包埋;然后将包埋有微生物的微球装层析柱,模拟微生物的原生态环境,在寡营养条件下对包埋微生物进行流动培养;随后用流式细胞仪对长有微菌落的微球进行分选,并对分选后的微菌落加入营养丰富的海洋培养基继续培养;最后对分离纯化的菌株进行保藏及分类鉴定。通过对一株纯培养细菌及两个海洋样品的包埋、培养、分选和鉴定,验证了该方法的可行性,可有效提高海洋微生物的可培养性。该技术采用所建立的三种适合活细胞包埋的方法,尤其是两相共流法和膜乳化法,改善了微生物的包埋条件,可更好的保证细胞的存活率;该技术除了采用琼脂糖为包埋材料外,还采用海藻酸钠和结冷胶作为包埋材料对微生物进行包埋,包埋基质的不同可能会增加微生物的可培养性;此外,本技术还增加了微生物的包埋数量,可使微生物问的交流更加密切,有助于提高微生物的可培养性。利用高通量培养分选法和平板分离法分析了极地底泥样品和青岛文昌鱼繁殖区海水及沉积物样品的微生物多样性。用高通量法共分离并保藏菌株辏
其中极地样品辏牟惴敝城株;利用平板分离法共分离菌株辏渲泻K株,沉积物样品株。对株高通量法分离极地菌株序列分析结果显示,这些菌株来自鱿妇嗳海篴一变形菌纲、变形菌纲⒀疽槐湫尉、放线菌厚壁菌和拟杆菌,共个属,其中有晡G痹诘暮Q笙妇轮序列与已知细菌的相似性小于%醋愿鼻蚓簟对株高通量法分离的文昌鱼繁殖区海水样品菌株的分析结果显示,分离菌株属于鱿妇嗳海直鹞猘一变形菌纲、丫一变形菌纲、拟杆菌门放线菌门⒑癖诰和稀有类群￡一变形菌纲宛辔⒕,共个属,其中株为潜在的细菌新种。对株平板法分离文昌鱼繁殖区海水样品菌株的测序结果表明,⒛飧司鷕和厚壁菌鍪簦渲株为潜在的细菌新种。对文昌鱼繁殖区沉积物样品的全部株菌的测序结果,发现菌株属于鱿妇群,分别是厚壁菌、,其中晡G痹诘南妇轮帧高通量培养分选法与平板分离法的结果比较表明,高通量法获得了更高的微生物多样性,并且能够培养出平板法不能或不易分离到的类群,如￡.变形菌纲和疣微茵门的菌株,提高了微生物的可培养性。利用高通量法使海洋微生物培养和分选效率得到了显著的提高。对一株分离自文昌鱼繁殖区沉积物的潜在海洋细菌新种进行了分类鉴定。通过形态学、生理生化特征、含量测定、醌和脂肪酸含量测定以及和快速鉴定系统等对该菌株进行了多相分类。经鉴定,,兼性厌氧,棒状,周生鞭毛,可游动,具三价铁和高价硒还原能力,课ィ饕V舅嵛狢,主要醌为甲基萘醌和泛醌·蚎一;和基因序