文档介绍：该【DNA指纹的遗传分析实验报告 】是由【老狐狸】上传分享，文档一共【5】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【DNA指纹的遗传分析实验报告 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。1
DNA指纹的遗传分析
【试验原理】
“DNA指纹”是指可以利用DNA差异来进展与传统指纹分析相像的身份识别。DNA指纹是以DNA的多态性为根底,而卫星DNA的觉察则是其最重要的奠基石。卫星DNA是由一短序列〔即重复单位或核心序列〕屡次重复而成,因此也有人称其为可变数目串联重复序列〔variablenumbersoftandemreprat,VNTR〕,在人类基因组中存在多种由不同重复单位组成的卫星DNA,重复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性,而卫星DNA的多态性则来源于重复单位的重复次数不同,并形成了众多的等位基因。列如,人类1号染色体上的VNTRD1S80,核心序列由16个核苷酸组成,拷贝数在14~41个之间,29种不同的等位基因。
1984年Jefferys等人首次将分别的人源小卫星DNA用作基因探针,同人类核DNA的酶切片段杂交,产生了由10多条带组成的杂交图谱,不同个体杂交图谱上带的位置就像指纹一样因人而异,因而Jefferys等人称之为DNA指纹图谱。产生DNA指纹图谱的过程叫做DNA指纹分析,目前包括PCR、RFLP〔限制性内切酶酶切片段长度多态性〕和RAPD〔随机扩增多态性DNA〕等方法。
DNA指纹图谱的根本特点:
多位点性:基因组中某些位点的小卫星重复单位含有一样或相像的核心序列。在确定的杂交条件下,一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。
高变异性:DNA指纹图谱反响的是多个位点上的等位基因的特征,具有很高的变异性。觉察两个无血缘关系个体具有一样DNA指纹图谱的概率仅为5×10-19,因此,除了同卵双胞胎,几乎不行能有两个人的DNA指纹图谱完全一样。
稳定的遗传性:DNA指纹图谱中的谱带能够稳定遗传,杂合带遵守孟德尔遗传规律。子代DNA指纹图谱中产生与双亲都不同的带的概率
〔基因突变〕~。DNA指纹图谱还具有体细胞稳定性,即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的DNA作出的DNA指纹图谱是全都的。
由于DNA指纹图谱具有这些显著的特征,他已经成为最具吸引力的遗传标记。Jeffreys是第一个意识到DNA指纹可以建立个人身份识别系统的人,并且首先将其用于亲子鉴定,移民审查和***侦破。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。此外,它还被用于医生诊断及查找与疾病连锁的遗传标记,探明动物种群的起源及进化过程,在作物的基因定位及育种上也有格外广泛的应用。
【试验材料、仪器及试剂】
人类口腔细胞。
仪器:微量移液器,小型离心机,恒温水浴锅,漩涡振荡器,PCR
仪,电泳仪,电泳槽,透射式紫外〔或凝胶成像仪〕。枪头,,
,棉签,使用前均需121℃高温灭菌
试剂:NaCl,琼脂糖,溴化乙锭,Na2-EDTA,SDS,Tris,ProteinaseK,冰醋酸,溴酚蓝,二甲苯***蓝,蔗糖,甘油,DNA相对分子质量标记,Chelex100树脂〔Bio-Rad〕,PCRpre-mix(TaKaRa)。
溶液配制:
〔1〕5%Chelex树脂:Chelex100(Bio-Rad)、50mmol/LTris-HCl10mL、用4mol/LNaOH调pH至11,室温可保存3个月,使用前充分混匀。
〔2〕%琼脂糖凝胶:,参与1×TAE溶液100mL微波炉加热溶解,冷却至60℃左右参与1μg/mL溴化乙锭
〔EB〕,缓慢混匀后倒胶板。
〔3〕溴化乙锭〔EB〕:用无菌水配制5mg/mL贮存液,工作浓度1μg/mL。留意;溴化乙锭为诱变剂,有致癌作用。配制、稀释和染色时必需戴手
套。
〔4〕():Na2-、NaOH2g,蒸馏水定容至100mL,室温保存。
〔5〕10×TAE电泳缓冲液:、、()20mL,蒸馏水定容至1000mL,室温保存。
〔6〕10×上样缓冲液〔Loadingdye〕:、二甲苯***、〔或甘油50mL〕,用60mL无菌水〔用甘油50mL时,49mL〕溶解上述试剂,再定至100mL,室温保存即可。
〔7〕10%SDS:SDS10g用无菌水溶解后〔可加热〕,定容至100mL,室温保存。
蛋白酶K溶液:20mg/mL蛋白酶K水溶液5mL、10%SDS1mL、无菌水94mL,冰箱冷藏。
无菌水:蒸馏水或去离子水,高温灭菌。
〔10〕1mol/LTris-HCl():,,加蒸馏水定容至100mL。
引物
Primer1:5’-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3’Primer2:5’-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3’
【试验操作】
1
收集DNA样本
先漱口,然后用灭菌的牙签充分擦刮口腔内壁,,使粘附在牙签外表的口腔细胞悬浮其中〔以能看到悬浮物为好〕。震荡10s,10000r/min离心1min。
从离心管中吸出970μL无菌水,留意不要吸到沉淀。
向离心管中参与200μL5%Chelex100,震荡10s混匀。
参与2μL蛋白酶K,混匀,56℃保温5min。
猛烈震荡10s,沸水浴8min。
〔6〕10000r/min离心3min,离心管中溶液分成上下两层:下层为Chelex100和细胞碎片的沉淀,上层溶液含DNA分子,可以直接用作PCR模板。
此DNA样本可在4℃或-20℃保存,必要时可在使用前再次加热并离心,使管内物质分层。
PCR扩增D1S80等位基因
。
预备冰盒,开头反响前尽量使PCR管保持在冰上。
依次参与以下成分,配制25μL体系的PCR反响溶液:
PCR pre-mix
引物1 1μL
引物2 1μL
口腔细胞DNA样本 10μL
加无菌水至总体积25uL。
轻弹管壁,混匀溶液。
离心10s,使管壁上的液滴落下。
按以下程序开头PCR反响:
94℃,1min
$
94℃,15s
68℃,15s
72℃,15s
30个循环
$
72℃,10min
$
4℃临时放置,直至开头电泳
PCR扩增产物鉴定与D1S80等位基因分析
预备冰盒。
1
取出完成反响的PCR管,放冰上待用。
取出10µ。
参与2µL上样缓冲液。
轻弹管壁混匀,再瞬时离心,使管壁上的液滴下落。
用1×%琼脂糖电泳凝胶。
〔7〕60V预电泳1~2min。
在凝胶上选一孔加6µLDNA相对分子质量标记〔DNA100bpLadder〕。
每人将刚刚预备好的10µLD1S80PCR扩增产物+2uL的上样缓冲液各自参与凝胶样孔,留意不要有气泡进入。
〔10〕60V电泳30~40min。
取出凝胶用清水漂洗5~10min。
凝胶用紫外观看,记录每个个体的DNA条带数目及其位置。。
四、结果与分析
本次试验所选择的方法是D1S80指纹图谱分析的常用方法。人群中D1S80座位的杂合率约为86%。从理论上讲,可能存在435种不同的等位基因组合。利用D1S80座位两侧序列设计的引物〔Kasaietal,1990〕,通过PCR反响,很简洁确定特定个体的D1S80等位基因构成,纯合体只有一条DNA带,而杂合体有两条不同的DNA带。
将小组的电泳结果拍照,附于下:
依据电泳结果,填写D1S80等位基因分析结果
1
小组成员
大小/bp
DlS80 DNA指纹特征
长度〔重复数〕
杂合/纯和
小组成员A
600
29
纯和
小组成员B
500
22
纯和
小组成员C
550
25
纯和
注:由于重复数为l的DIS80PCR产物长161bp,所以,重复数每增加一个,序列增加长度16bp。据此可以催算:
重复数=1+〔PCR产物大小-161〕/16
【争论】
本人的条带是其次条,不是很清楚,缘由可能是样品浓度过稀,也就是一开头刮取的口腔内壁细胞太少了,水浴时又洒了少许,以至于后来PCR也没扩增出。还有一个可能的缘由就是DNA的纯度不够,带有太多的杂质,从而跑电泳时DNA被杂质阻滞,因此效果不太好。
跑出的条带上的DNA是人源小卫星DNA—DIS80的PCR产物。它是一种具有多位点、高变异、稳定遗传的DNA分子,而且每个人的DIS80DNA中重复序列的数目是不同的,所以它比传统的指纹分析更便利、快捷、准确。,有两次水浴的步骤,确定要留意将离心管的盖子盖紧,由于离心管是灭菌的,所以假设盖子盖的不紧,就会从沸水浴中炸开,自己就是这种状况,导致条带不清楚。
思考题:
用PCR、RFLP、RAPD方法产生DNA指纹图谱各有哪些利弊?
答:PCR作为现代生物学争论的一种常用方法,具有特异性高、灵敏度高、简便节约、经济的优点;但是它最大的缺点是对不同的片段条件不同,所以很难把握,而且必需要得到目的基因片段。
RFLP这种方法比较稳定,但RFLP试验操作繁琐,检测时间长,本钱较贵,不太适合大规模的分子育种。
PAPD相对RFLP来说,更加省时省力,不需要进展DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤,但是它不能用来测定多态性是由父本还是母本产生的,而RFLP这种技术可以做到,而且PADA这项技术源于PCR技术。
假设一个个体的两个D1S80等位基因之间相差一个重复,是否照旧可以用琼脂糖凝胶电泳检测,为什么?
答:我认为假设DIS80等位基因之间只差一个重复序列的话,就不能使用琼脂糖凝胶胶电泳检测了。由于琼脂糖凝胶电泳的原理是利用琼脂糖的网状聚合构造,分子量的DNA不易穿过,泳动距离就近,反之亦然。但是一个重复序列也只有166bp。实在太小了,琼脂糖凝胶不能将它们分别。
1