文档介绍：中南民族大学
硕士学位论文
两个osvdac基因的原核表达及其对水稻的遗传转化
姓名:秦圣光
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:王春台
2011-05-28
中南民族大学硕士学位论文
摘要
电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)是一种由小
的多基因家族编码的离子孔道蛋白,它们主要依赖电压来调节其对阴阳离子的选
择性。VDAC 主要存在于线粒体膜上,它除了在线粒体的能量代谢和物质代谢中
起重要性作用外,还与细胞凋亡的诱发有关。
本实验室前期通过生物信息学方法对粳稻日本晴全基因组扫描,发现在日本
晴基因组中至少存在 8 个 vdac 的同源候选基因。相比在哺乳动物中仅含三个的
vdac 基因,在水稻中的 8 个同源 vdac 基因所编码的蛋白在结构、定位及其生物
学功能,值得深入研究。
本研究首先克隆获得 vdac3 和 vdac5 两个基因的 ORF,探讨两个原核高效表
达条件和蛋白纯化条件,制备其抗体;与含 GFP 的植物表达载体重组,遗传转
化,期望研究其细胞定位。取得的研究结果如下。
1. 根据 osvdac3 和 osvdac5 设计特异性引物,通过 PCR 从 YTB 的 cDNA 中
扩增获得 2 个 vdac 基因的 ORFs,与含有 His 标签的原核表达载体 pET-30a 重组,
获得了重组质粒 pET-30a-osvdac3 和 pET-30a-osvdac5;将重组质粒转化大肠杆菌
BL21 感受态细胞,重组蛋白诱导表达的最佳条件为 15℃, mmol/L IPTG 诱
导 17 h;目的蛋白通过亲和层析分离纯化,经 SDS-PAGE 分析显示为单一带。
分离纯化的蛋白质样品,经过其 N 端的质谱检测分析,结果与预期的 2 个基因
的表达产物一致;用纯化的 2 个原核表达蛋白进一步制备的抗体,western blot
分析表明均具有较好的特异性。
2. 以获得的 vdac3 和 vdac5 基因的 ORFs,构建了 CaMV35S∷osvdac3∷GFP
和 CaMV35S∷osvdac5∷GFP 过表达载体,以水稻 YTA 作为其遗传转化的受体,
获得一定数量的转化苗,为进一步的组织细胞定位奠定了基础。
关键词:水稻;VDAC;原核表达;抗体
I
两个 osvdac 基因的原核表达及其对水稻的遗传转化
Abstract
Voltage-dependent anion channel (VDAC) is a kind of ion channel protein,
which is encoded by a small multi-gene family, They primarily depend on voltage to
regulate the selectivity of negative and positive ions. VDACs locate mainly in the
mitochondrial membrane, It is not only plays a decisive role in energy metabolism
and mitochondrial metabolism, but also are in relation to induced apoptosis.
Previous studies in our laboratory has mapped eight vdac candidate genes on rice
genome by whole Nipponbare and 9311 genome scanning with different
bioinformatics tools. Compared with three vdac genes identified, why there are eight
vdac genes existed in rice genome is worthy to probe for their struction, location and
biologic function.
In this article, two ORFs for vdac3 and vdac5 genes are cloned, and their
efficient prokaryotic expression and protein purification conditions are optimi